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1、第24章 病毒感染的检查方法 与防治原则,第一节 病毒感染的检查方法,病毒感染的检查,检测内容,查病毒,查特异性抗体,病毒颗粒病毒抗原病毒核酸病毒酶类：如逆转录酶,电镜直接观察光镜检查包含体分离培养,一、标本的采集与送检,原则基本与细菌相似，但应注意： 1.用于分离病毒或检测病毒及其核酸的标本应采集急性期标本 2.标本用“双抗”或两性霉素B处理 3.低温保存，尽快送检 4.血清学诊断采双份血清（发病初期和病后23周）,二、病毒的分离与鉴定,（一）病毒的分离培养细胞培养（cell culture）鸡胚接种（egg inoculation）动物接种（animal inoculation）,需进行病
2、的分离与鉴定的情况： 需对疾病进行病原学的鉴别诊断； 发现新的病毒或再发性病毒性疾病； 对治疗疾病具有指导性意义（尤其病程较长者）； 监测病毒活疫苗效果； 病毒性疾病的流行病学调查； 病毒生物学性状等的研究,一般程序：,标本,无菌处理,动物接种 鸡胚培养 细胞培养,指标阳性指标阴性,病毒鉴定,盲传23代,指标阴性,病毒阴性,1.细胞培养单层细胞培养（monolayer cell culture） 分类悬浮细胞培养（suspended cell culture）原代细胞（primary cell） 细胞种类 二倍体细胞（diploid cell）传代细胞系（continuous cell lin
3、e）,病毒的细胞培养,细胞培养瓶,单层细胞,1）.细胞培养的分类,(1)原代和次代细胞培养,组织 组织块 分散的单个细胞 单层细胞,剪碎培养基,(原代细胞),单层细胞,(次代细胞),传代培养,蛋白酶,原代和次代细胞培养的特点：对多种病毒敏感生长能力有限, 获取成本高可携带潜伏病毒,(2)二倍体细胞培养体外分裂50100代仍保持二倍体染色体数目，可用于病毒分离和疫苗生产。,特点：对多种病毒敏感不带异种蛋白(人源性)不带病毒，无致瘤潜能可传50代左右,(3) 传代细胞培养,特点：对多种病毒敏感性高繁殖能力高，传代时间长有致癌危险，不能用于疫苗生产,细胞培养的优点： 便于纯化病毒； 可直接观察细胞变
4、化； 可对病毒的复制过程进行基础性研究； 可进行空斑纯化病毒克隆； 可滴定病毒含量常用TCID50表示，即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变的病毒量,2.鸡胚培养 采用孵化914天的鸡胚绒毛尿囊膜（allantocherion）：痘苗病毒、人类疱疹病毒尿囊腔（allantoic cavity）： 流感病毒、腮腺炎病毒 接种部位羊膜腔（amniotic cavity） ：流感病毒的初次分离卵黄囊（yolk sac）： 嗜神经病毒,鸡胚培养,优点：易管理，不带微生物，成本较低 缺点：操作程序复杂,3.动物接种应用：尚无敏感细胞的病毒培养动物：兔、鼠、黑猩猩、猴等优点：结果易观察，可建立动物模
5、型缺点：有饲养条件要求，费用高，动物体内常带有潜伏病毒,1病毒增殖鉴定（病毒在培养细胞中增殖的指征） (1)细胞病变效应（cytopathic effect, CPE ） 细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落等（多数病毒）； 形成多核巨细胞或称融合细胞（麻疹病毒、巨细胞病毒、呼吸道合胞病毒等）； 在培养细胞中形成包涵体（狂犬病病毒、麻疹病毒等）。,（二）病毒的鉴定,细胞变圆、聚集、坏死、溶解或脱落,麻疹病毒感染细胞,呼吸道合胞病毒感染细胞,形成多核巨细胞或称融合细胞,形成包涵体(inclusion body),病毒感染细胞后形成嗜酸性或嗜碱性包涵体,狂犬病毒感染后在脑细胞的胞浆内出现嗜酸性圆形或椭
6、圆形的包涵体，可供辅助诊断.,腮腺炎病毒感染细胞,(2)红细胞吸（hemadsorption）,病毒囊膜表面血凝素(HA) 红细胞表面HA受体,(3)干扰现象（interference）,风疹病毒人胚肾细胞 病毒增殖，CPE(),埃可病毒人胚肾细胞 病毒增殖，CPE(),人胚肾细胞,风疹病毒？ 埃可病毒,CPE(-)风疹病毒(+)埃可病毒(-) CPE(+)风疹病毒(-)埃可病毒(+),(4)细胞代谢改变细胞代谢变慢pH变化减慢,2.病毒形态学鉴定,电子显微镜：设备、操作复杂，应用受限 光学显微镜：可见大病毒（痘类病毒），对一般病毒检测意义不大,3.病毒血清学鉴定,鉴定病毒种、型、亚型(1)血
7、凝抑制试验（hemagglutination inhibition test）正粘病毒型与亚型鉴定病毒鸡红细胞凝集（血凝试验）病毒特异性抗体鸡红细胞不凝集（血凝抑制试验）,(2)免疫标记法（FIA、EIA、RIA）多种病毒鉴定(3)凝胶免疫扩散试验(gel immuno-diffusion test)多种病毒鉴定,4.病毒分子生物学鉴定,抗原变异病毒基因的鉴定核酸扩增核酸杂交基因芯片基因测序,（三）病毒数量与感染性测定,1.血凝试验：病毒总量（活病毒死病毒）,2.蚀斑形成试验（plaque formation test） 3.50组织细胞感染量（50 tissue cultureinfecti
8、ous dose, TCID50）,感染性病毒量,(四) 新病毒的鉴定,核酸类型的测定 理化性状的检测 形态学鉴定 血清学鉴定 基因测序和生物对比,三、病毒感染的血清学诊断,需进行血清学诊断的几种情况： 采取标本分离病毒为时已晚 目前尚无分离此病毒的方法或难以分离的病毒 为证实所分离的病毒的临床意义 进行血清流行病学调查等,1.中和试验（neutralizing test）,病毒中和抗体（作用于病毒表面抗原(衣壳、包膜）)的抗体 病毒失去感染性特点：特异性高，抗体维持时间长 应用：人群免疫情况的调查临床诊断少用,2.补体结合试验 （complement fixation test）,用已知病毒
9、可溶性补体抗原（病毒的内部抗原）检测病人血清中相应的补体抗体特点：特异性低，抗体出现早，消失快应用：近期感染指标。,四、病毒感染的快速诊断,数小时内出结果 病毒颗粒 病毒成分（抗原或核酸） 早期抗体检测（IgM）,（一）形态学检查,电镜和免疫电镜检查 普通光学显微镜检查包涵体,（二）病毒成分检测,1.病毒蛋白抗原检测免疫标记技术2.病毒核酸检测核酸扩增技术 核酸杂交技术 基因芯片技术基因测序,（三）早期抗体检测,可诊断急性感染特异性IgM抗体：孕妇感染风疹病毒 EBV早期抗原抗体,第二节 病毒感染的特异性预防,微生物及其代谢产物生物制品 动物免疫血清 （biological products）
10、 免疫细胞细胞因子防治和诊断感染性疾病,灭活疫苗（inactivated vaccine） 活疫苗（living vaccine） 重组载体疫苗（recombinant carrier vaccine） 亚单位疫苗（subunit vaccine）化学提取或人工合成疫苗重组疫苗（recombinant vaccine） 核酸疫苗（nucleic acid vaccine）,一、人工主动免疫常用生物制品,二、人工被动免疫常用生物制品,免疫球蛋白血清丙种球蛋白细胞免疫制剂IFN-、细胞因子 IL-2、IL-6、IL-12 TNF 、CSF 淋巴因子激活的杀伤细胞LAK细胞,第三节 病毒感染的治疗,核苷类药物非核苷类反转录酶抑制剂 蛋白酶抑制剂 其他抗病毒药物 干扰素和干扰素诱生剂中草药 基因治疗剂 治疗性疫苗,抗病毒化学制剂,反义寡核苷酸 干扰RNA 核酶（ribozyme）,
