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1、1,第六章 实验中医学常用实验方法及其应用,2,许多初涉中医实验研究的人，最大的问题是不知道如何着手研究、观察什么指标。比如，发现某张中药复方治疗肝癌，临床报道有效，打算开展实验验证其疗效，揭示其作用机制，怎么办？从何入手？选用哪些实验室检测指标，为什么，实施具体步骤如何？,3,本章介绍实验中医学的常用实验方法和技术，以及应用这些方法研究中医的典型范例。希望通过集中对常用具体实验方法的介绍，让大家了解不同学科主要方法、异同，各自的特点和优势，以及相互间的联系，学会如何根据需要选择不同的方法或不同方法的组合。各节中的研究现状和范例，希望对如何应用具体某一实验手段研究中医有比较具体的认识，通过典型
2、范例的介绍分析，使这种认识更加深化。,4,教学要求：1掌握生理学、形态学、生物化学、分子生物学等不同学科实验研究方法的特点和优势。2掌握依据实验研究的不同目的，选择合适的实验技术和综合多种技术。3了解生理学、形态学、生物化学、分子生物学的主要方法及其在中医研究中的应用。,5,了解不同实验方法与技术的原理十分重要。这有助于因地制宜地选择适当的实验方法；而且，由于受到实验室条件、技术支撑的限制，例如检测设备昂贵、技术难度大等，许多实验室会将一些实验委托专业公司或实验室开展。此时，了解那些实验方法与技术的原理有助于对合作单位技术、条件的考查，协议与合同的拟定，以及实验数据的分析。,6,第一节 生理学
3、方法及其在中医研究中的应用,7,本节的教学目的和要求：1掌握生理学实验研究方法的特点和优势。2了解生理学的主要方法及其在中医研究中的应用。3掌握依据实验研究的不同目的，选择合适的生理学实验技术和综合多种技术。,8,推荐一些参考书目：1沈岳良主编. 现代生理学实验教程M. 北京：科学出版社, 2002. 2 方福德等主编. 现代医学实验技巧全书（下册）. 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社. 1995.3 徐叔云等主编. 药理实验方法学. 人民卫生出版社. 1994.4 韩济生主编. 神经科学纲要. 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社. 1993.5 陈次青. 生理学. 人民卫生出版社.
4、 1991.6 季钟朴主编. 现代中医生理学基础. 学苑出版社. 1991.7 周衍椒等主编. 生理学方法与技术（第一三集）. 科学出版社. 1984, 1987.8 梅懋华等主编. 生理学方法与技术（第四集）. 科学出版社. 1986.,9,生理学是研究生命现象机制的自然科学。由于生物学科的迅速发展，解剖学、形态学、生物化学、药理学、细胞生物学、分子生物学等纷纷独立出来，使当代生理学演变成为主要以研究物理性功能为主的生物物理学。,10,一、生理学的主要方法容易联想到巴甫洛夫系列狗的条件反射实验、小鼠行为学研究、航天领域动物失重生理学观察，等等。丰富了生命科学的手段和内容。现代生理学研究方法：
5、在人工控制的实验条件下对生命活动进行客观观察和科学实验。,I.P.巴甫洛夫（俄国人，1904年） 从事有关消化系统生理研究,11,生理学根据研究时程的不同，可分为急性实验和慢性实验： 急性实验：包括离体组织、器官实验，其优点是可以人工控制条件，有利于排除其他因素，专对某器官、组织的基本功能和生理特性进行较细致的观察与分析。其缺点是器官、组织脱离了动物整体，或动物受解剖或麻醉的影响，因此所得结果常有一定的局限性。 慢性实验：是在完整的正常动物机体上对某种生命现象进行观察和实验研究。这种方法所得资料更符合正常的生理活动规律，但实验的难度大、要求高。,12,生理学根据研究层次的不同，又可以分为整体水
6、平、器官水平和细胞水平等3个水平。生理学根据研究系统的不同，又可以分为神经、内分泌、心血管、呼吸、消化、泌尿等系统生理实验方法。教材主要介绍电生理常用仪器和若干系统的生理研究方法：,13,（一）生理学实验常用仪器生理学实验仪器一般由五大部分组成，即刺激系统、探测系统、信号调节系统、记录系统和机体（或离体组织）生命维持设备。,14,1刺激系统为使机体或离体组织细胞兴奋，需要给予刺激，常用的刺激装置为电子刺激器。电子刺激器包括刺激电极，后者有普通电极、保护电极、乏极化电极之分。注意：除电生理外，其他刺激因素或干预因素，可以是药物（试验用药物、某一受体或通路的阻断剂等）、其他物理因素等。,15,电子
7、刺激器产生的刺激脉冲多用矩形波，可调参数包括： 幅度（强度）； 波宽（时间）； 频率； 延迟（从触发脉冲到矩形波刺激之间的一段时间）； 同步输出，用于触发示波器的外触发扫描，也可用于触发其他需要与刺激同步的仪器启动工作； 刺激方式，包括单刺激、连续刺激及双脉冲刺激等。,16,2探测系统当生理信号是电信号时，探测系统可以是引导电极，包括记录单细胞电活动的玻璃微电极，以及记录群细胞电活动的金属电极。当生理现象为其他某种能量形式时，如机械收缩、压力和声音等，探测系统又可以是换能器，如张力换能器、压力换能器、绑带式呼吸换能器、呼吸流量换能器，还有脉搏、温度、心音等换能器。,17,3信号调节系统信号调节
8、系统是一种放大器或放大器的组合，有前置放大器、微电极放大器等因此必须加接一个高保真放大的生物电放大器将这些微弱信号先行放大，方能在示波器或记录仪上观察或描绘出生物电信号的变化波形。生物电放大器应具备下列性能： 频率响应范围大（通频带从0100kHz）； 有足够的放大能力；高的辨差比； 低噪声； 高输入阻抗。经典实验中各式各样的杠杆和传动装置也起着信号调节作用。,18,4显示、记录系统记录系统通常使用记纹器、示波器或记录仪。记纹器是一种经典的记录装置，已被示波器或记录仪取代。由于计算机技术的发展，计算机生物信号采集系统在生理实验中已广泛应用，有代替刺激器、放大器、示波器和记录仪的趋势。,19,（
9、1）阴极射线示波器：该仪器是用来观察与测量电压、电流波形与数值大小的一种电子仪器。由于它的惰性小，灵敏度高，测量的频率范围又很宽，所以在电生理实验中用来显示微弱而变化迅速的生物电。根据生物电特点，示波器应为高灵敏度，扫描速度慢（2s/cm1s/cm），频率为1MHz。有条件的实验室，可用数字存贮示波器代替普通示波器。它能把信号以数字形式存贮起来，随意调出。而且可以长时间显示在荧光屏上以利于分析和照相。它可以把信号数据直接送入通用计算机接口，也可以把存贮数据模拟输出，连接记录器描记出生物电位。,20,（2）多道生理记录仪：多道生理记录仪是可以同时观察、记录、处理生物电，例如脑电、心电、肌电，以及
10、血压、呼吸、肌肉收缩曲线等多种生理变化参数的综合性电子仪器。多道生理记录仪一般由传感器（输入部分）、前置（前级）放大器、控制器、信号放大部分（后级放大器）、显示和描记部分（示波监视器、记录仪），及机架与电源供应等不同部分组成，国内常用的有二道、四道、八道记录仪。,21,（3）生物信号采集处理系统：这是一种基于计算机的专用生物电数据采集和处理仪器，已经日益广泛地作为生理实验强有力工具。它主要用于各种生物电如神经动作电位、心电、脑电、肌电，各种诱发电位，以及血压、脉搏、呼吸等通过换能器转换来的生理参数电信号的测量，能对上述各种信号进行实时处理，具有波形采集、叠加平均、资料分析、记忆示波等多种功能，
11、是教学和科研的有用工具。,22,（4）膜片钳实验装置：做膜片钳实验除了一般电生理所需的仪器外，特殊的仪器有膜片钳放大器、倒置显微镜、三维液压微操纵器、微电极拉制仪和计算机及相关软件等。因为膜片钳实验所用的标本多数是放在培养皿中的细胞，需要在相差倒置显微镜下，借助微操纵器进行操作。膜片钳放大器内通常含有一个标准的差分放大器线路，将记录到的电流以电位差的形式输出，所以膜片钳放大器的核心部分是一个高增益的电流-电压转换器，具有高输入阻抗、低躁声、宽频带等特性。此外，还有频率提升部分、加法器、瞬时补偿和钳位放大器等部件组成。,23,膜片钳装置和检测到的信号,24,膜片钳装置和检测到的信号,25,5机体
12、或离体组织生命维持设备/保障系统动物人工呼吸机；恒温槽；小肠平滑肌、血管、气管和子宫等离体组织灌流装置；Langendorff心脏离体灌流装置；神经屏蔽盒等。,体外组织灌流和生理检测系统,26,此外，生理学还广泛涉及一些专门用途的实验设备，例如阻抗血流仪、微循环仪、血气分析仪、电解质检测仪等；而计算机与有关支持软件也愈来愈普及地被使用，涉及生物信号记录分析系统、图像处理系统、多媒体、局域网等。,27,（二）生理学实验常用方法根据生理学研究的层次不同，如中枢神经系统、神经与肌肉、内分泌与生殖、心血管与循环、血液、呼吸、消化、感觉器官、代谢、排泄、泌尿等系统，发展并分类成许多不同的实验方法。,28
13、,1神经系统电生理学方法是研究神经或神经-肌肉机能状态的常用方法。尤其是细胞外记录方法，利用可兴奋组织（如神经、肌肉）的生物电现象，观察组织细胞的正常功能、病理变化及药物的作用。细胞外记录法是把引导电极安放在神经、肌肉组织的表面或附近，引导神经、肌肉组织的电活动。由于可兴奋细胞兴奋时其兴奋的部位产生去极化，未兴奋的部位处于正常极化状态，在容积导体中的两部位间由于电位不同，电流从一点流向另外一点，放置于细胞表面的电极就会记录出两者之间所产生的电位差。,29,屏蔽室和正在引导的大鼠听力电信号,30,2循环系统无创伤心功能测定（包括心电图ECG、心音图PCG、颈动脉搏动描记曲线CPT和心尖搏动图AC
14、G）、心室肌收缩功能的测定、血管张力测定、脉搏图的测定等方法是常用的方法。用微循环显微镜系统进行甲襞微循环观察的方法是研究血瘀证的常用方法。,大鼠尾血压测量仪 甲襞微循环观察,31,3呼吸系统通过呼吸运动描记方法，可以测定肺功能状况，这些方法包括胸腔内压记录、胸廓运动记录、呼吸肌活动及肌电图描记、呼吸气流速度测定等方法。例如观察“肺气虚”时肺功能受损情况，或通过检测肺泡组织中一些理化因子的变化探究肺的通调水道的理论，这些方法都是经常使用的。,32,4消化系统胃肠电图和胃肠运动波的记录方法能反应胃肠功能状况，是研究“脾主运化”的常用方法；木糖吸收试验和唾液淀粉酶活性测定已被公认为脾气虚证的客观方
15、法。,胃肠电图仪,33,二、实验中医学应用生理学方法的现状与案例长期以来，中医学形成了一整套独特的理论与方法，诸如藏象、经络、气血津液等，与当代西医学有所异同。例如“肾藏精”、“主生殖”、“主水液”、“肾通于脑”、“肾开窍于耳”，按现代生理学的观点看，这里的肾是一个宽泛的生理概念，包括内分泌、生殖和泌尿等系统的功能。这些理论的物质基础是什么？本质是什么？是否还蕴涵着人类至今尚未认识的生命现象和规律？以及基于中医理论采用针灸、中药复方、中药及其有效成分的作用机制是什么？这些构成了采用生理学方法研究的主要动因。,34,20世纪60年代起，我国针麻与针灸镇痛原理的研究；70年代起，肾与耳原理的研究，
16、以及80年代起，脾功能的研究等。（一）肾的研究肾阳虚证具有下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴上不同环节（层次），不同程度的功能紊乱；进一步的研究涉及到甲状腺轴与性腺轴功能，推论肾阳虚证的主要发病环节为下丘脑（或更高中枢）的调节功能紊乱。,35,1肾与耳的关系灵枢脉度篇说：“肾气通于耳，肾和则耳能闻五音矣。”肾虚引起的耳鸣、耳聋及链霉素中毒性耳聋用补肾方法防治取得一定效果。那么，中医肾与耳关系中的肾在结构和功能上究竟指的是什么？又是通过什么生理机制来达到这种联系？,36,（1）肾与耳关系物质基础的现代理论假说及其实验1）醛固酮与肾和耳的关系研究背景： 肾脏和内耳中的某些细胞在生理功能、形态结构、酶的含量以及药物反应等方面均有相似的特性。 对内耳有毒性的抗生素（如新霉素、卡那霉素等）对肾脏亦有毒性作用。 抑制肾功能的利尿剂（如利尿酸、速尿）同样可以使人和动物耳聋，并对内耳生物电产生明显的抑制作用。 先天性肾功能障碍（Alport综合征）常伴随先天性耳聋。 晚期肾功能不全患者也常出现听力下降。,
