《激光诱变选育果胶酶高产菌株》由会员分享，可在线阅读，更多相关《激光诱变选育果胶酶高产菌株（148页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、,激光诱变选育果胶酶高产菌株,一、实验目的 1.了解果胶酶的应用领域。 2.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。 3.通过激光诱变技术筛选出高产果胶酶的菌株。 二、实验设计简介 以腐烂的苹果、橘子、柚子和山楂等水果为材料，分离筛选出一株产果胶酶的高产菌株，采用波长632.8 nm，功率为11.5 mw的He-Ne激光对其进行诱变，结果得到果胶酶产生时间早、活性强的优良菌株。有望用于果胶酶的生产。,实验设计背景介绍,一、背景简介 果胶酶(Pectinase)是指分解果胶类物质的多种酶的总称，在食品加工、饲料加工、造纸、环境保护和诱导植物抗病等方面都有很大的应用价值。果胶酶可源于动物、植物和微生物
2、。但动植物来源的果胶酶产量低且提取困难，不能满足生产的需要，而微生物则因其生长快速等特点成为果胶酶的主要来源。自然界产果胶酶的菌株很多，,据报道已有40多种，主要有曲霉属(Aspergillus）、青霉属(Penicillinum)、侧孢酶属(Sporotrichum)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)及某些兼性厌氧细菌等。这些微生物所产果胶酶的活力大小各不相同，筛选果胶酶高产菌株，仍是目前亟待研究的课题。本文应用选择培养基分离、纯化产果胶酶菌株，通过激光诱变，筛选出酶活力高而且稳定的产果胶酶菌株，为今后的进一步研究应用奠定了基础。,果胶酶的应用,一、食品行业的应用 果胶酶与葡萄酒,
3、法国干邑白兰地,巴塞罗那玫瑰红,南非席拉,主要内容,果胶酶的简介 影响果胶酶作用的主要因素 果胶酶在葡萄酒酿造中的运用 葡萄酒的功能,果胶酶简介,果胶酶是现代葡萄酒酿造中的重要辅料，大 多数是由黑曲酶 (Aspergillus 11增OT)经特殊工艺制成的液体果胶酶或固体果胶酶。葡萄酿酒中常用的果胶酶通常是复合果 胶酶，含有果胶裂解酶，果胶酯酶和聚半乳糖醛酸酯酶(Polygalacturonases，PG)等。,影响果胶酶作用的主要因素,一.葡萄状态和处理手段对果胶酶作用的影响： (1)不同葡萄品种所含果胶种类和数量会有所差异，如玫瑰香葡萄的果胶含量显著高于霞多丽葡萄 ，因此前者比后者澄清难度
4、更大 。 (2)即使是相同葡萄品种，因为成熟度和地理环境的不同，果胶 酶 的处 理 效果也会有所差异。例如同样是赤霞珠，采用果胶酶处理后，产于炎热智利美宝谷的酒样，其色度较对照组提高比例高于相同处理的法国波尔多酒样。 (3)受灰绿葡萄孢霉菌侵染的葡萄，在侵染后所释放出的大量葡聚糖会加大果 胶酶澄清难度。,(4)在萄前处理和发酵过程中，由于采摘方式 、果实运输、除梗率、压榨技术和浸渍强度的不同,葡萄受到的损坏程度也有所不同。 二.处理介质环境对果胶酶作用效果的影响 : （1）温度对果胶酶活性的影响很大，从图中可以看出该果胶 酶活性的理想温度为45，但对葡萄酒酿造而言，此温度是不适宜的。通常葡萄酒
5、酿造的理想温度为 1 43 2之 间 ，而白葡萄酒的发酵 温 度更 低 (1 420之间)，这对果胶酶的活性影响很大。通常在低温条件下会产生两个结果 ：一是 葡萄汁的粘度增加会降低固体物质的沉降速度；二是果胶酶活性下降。,（2）对大部分果胶酶而言 ，最理想的pH值是45左右 (图6)，而这个pH值在葡萄汁中基本不可能出现 。通常,果胶 酶作用葡萄汁或酒 的pH值 介于2.93.5之间.不同的pH值 ，对果胶酶活性的影 响很 大 (图6)。如果pH值过低 (HpH3.2)， 果胶酶的活性会下降 ，应通过增加果胶酶用量 ,来达到最佳处理效果。特别提 示 ，针对pH高3.63.7的葡萄酒 ，果胶酶的
6、活性显著增强，但 在实践中却会由于静电现象而导致沉降困难。,果胶酶的作用,澄清葡萄汁和葡萄酒，提高葡萄汁和葡萄酒的过滤通透性 浸提葡萄中的有益多酚物质,通常，葡萄中含有的大量果胶会导致澄清困难、出汁率低、 过滤效率低下等 问题 。同时 ，在浸渍过程 中，这些存在于葡萄皮和果 肉中的大量果胶会阻碍色素和单宁的浸提、溶解和稳定，从而增加了葡萄酒酿造的难度。基于上述原 因，采用果胶酶处理过量果胶是非常必要的 。当在适当工艺阶段添加果胶酶 (如超浓缩果胶酶HC)后 ，果胶将被较为彻底地分解，使得葡萄汁澄清和过滤更为容易，同时大大提升了出汁率，从而提高 自流酒产量。,在传统浸渍工艺过程中，细胞内的有益多
7、酚物质 (如色素、单宁等)在向外扩散的过程 中会被细胞壁所阻碍。在此情况下使用浸渍果胶酶，一方面可加速色素和单宁的浸渍溶解，例如19992003年对法国波尔多赤霞珠葡萄酒的研究发现，当葡萄成熟度不佳时 ，运用果胶酶EX-V可迅速提高葡萄酒色素和单宁的浸提效果 另一方面还可提高色素和单宁的稳定性 ，同样在1999到2003年对法国波尔多赤霞珠葡萄酒的研究中，研究人员对比了浸渍阶段使用果胶酶和未使用果胶酶酒样连续5年内的颜色、花青素和单宁的变化情况 ，发现使用EXV处理的酒样 ，其颜色、花青素和单宁的稳定性都得了很大提高。,葡萄酒的功能,保健作用：增进食欲，滋补、助消化、利尿、减肥、美容和杀菌 预
8、防疾病功能：心血管病、脑血栓、肾结石、感冒和提高记忆力。,2、果汁制造和果酒酿造 其应用主要集中在如下几个方面： (1)提高果汁出汁率，加速果汁澄清 (2)制备混浊果蔬汁； (3)单细胞食品的制备，原果胶酶能作用于植物组织产生松散的单细胞。酶处理的果蔬组织所获得的单细胞，细胞完整，各种营养成分保存 完好，表面及内部的张力较小而易与牛奶、酸奶、冰淇淋、混合，且易被胃蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶消化，适宜用作老人、婴儿以及病人的食品； (4)果酒酿造时果汁的预处理,3、作为天然的防腐剂 果胶酶降解果胶而得到的果胶分解物对食品有很强的抗菌作用，特别是对大肠杆菌有显著的抑制增殖作用。20世纪90年代中期，果
9、胶分解物作为天然防腐剂开发成功。目前，国外以果胶分解物为主要成分，配合其它天然防腐剂，已广泛应用于酸菜、成鱼、牛肉饼等食物 4、果实的脱皮 将含有纤维素酶和半纤维素酶的粗果胶酶制剂作用于果实皮层，能使皮层细胞分离，结构破坏而脱落。如柑桔囊衣、一莲子的肉衣和人蒜的膜层经过粗果胶酶处理后，可以很快地脱落。,5、榨油 果胶酶是一种细胞壁降解酶，它可以用于植物油的榨取过程，如在橄榄油榨制时加入果胶酶可破坏起乳化作用的果胶提高油的收率，而且榨出的油贮存时也非常稳定，多酚类物质和维生素含量也有所增加。,果胶酶在其他方面的应用 在纺织和造纸工业中的应用： 纺织产品的脱胶 造纸业的生物制浆 在生物技术领域中的
10、应用： 纯化植物病毒 DNA的提取 制备植物细胞原生质体 在医药行业中的应用： 植物药的提取 治疗胃结石,生物081李春林,饲料添加剂：,洗涤剂：,食品污垢往往难于从被污染的底物上有效地去除。由水果和或蔬菜汁形成的“干涸”污渍特别难于除去。加入含碱性果胶酶的洗涤剂，对这些污渍具有良好的去污性能。,碱性果胶酶与纤维素酶、半纤维素酶等配合，可降解植物细胞壁中果胶和纤维，促使淀粉、脂类、维生素和蛋白质等释放出来，从而提高了饲料的营养价值；碱性果胶酶添加到饲料中可降低饲料的黏度，促进饲料在动物消化道内的消化吸收旧。,诱变方法 物理方法 紫外诱变 微波诱变 激光诱变 离子束诱变 化学方法 复合因子诱变
11、基因工程方法,激光诱变 激光辐射对微生物影响的是光、热、压力和电磁场效应的综合应用，能够引起细胞DNA或RNA，质粒、染色体畸变效应，酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。光量子对细胞内含物中的任何物质一旦发射功能作用都可能导致生物有机体在细胞学和遗传学特性上发生变异，不同种类的激光辐射生物有机体，所表现出的细胞学和遗传学变化也不同。激光以其高亮度、高方向性、高相干性以及单色性，在微生物育种领域已得到广泛应用。而且，不同种类的激光辐照微生物，所表现出的细胞学和遗传学变化也不同，这也给微生物的诱变育种提供了便利条件。,果胶酶的分析方法 进行果胶酶的研究需要有可靠的酶分析定量方法，常用
12、的果胶酶定性定量分析办法： (1)透明圈法 根据果胶降解物在高碘酸中的溶解性有差别来定性判断果胶酶是否存在的一种方法。由于大分子聚合物不溶于酸，果胶酶降解的小分子溶于酸从而在琼脂培养摹板上形成透明圈。基本方法是：用果胶酶底物、缓冲液、淀粉和琼脂配成溶液铺板，然后加入少量的酶液，注入一点，反应一段时间后，,加入高碘酸，如果该酶有活性，注入酶的点将出现透明圈。下一步，可以倾出高碘酸溶液，加入砷酸钠溶液，根据淀粉与碘的颜色反应，更易清楚的判明透明圈的存在。该方法对于果胶酶产生菌的筛选是方便的，而且可以变换底物及pH等区别不同种类的果胶酶。本研究所用的刚果红染色法是透明圈法的一种改良方法，主要原理是刚
13、果红染料可与多糖水解物形成有浓郁色泽的复合物，在果胶为唯一炭源的培养基中如果培养物具有产果胶的能力，就可以形成明显的绛红色水解圈。这一方法效果良好且果胶用量很少、成本低，是一种较好的筛选方法。,（2）次碘酸钠法（滴定法） 1.果胶酶的测定原理 果胶酶水解果胶，生成半乳糖醛酸，后者具有还原性醛基，可用次亚碘酸法进行定量测定，所生成半乳糖醛酸的量可用于表示果胶酶的活力。,酶解反应： 果胶,半乳糖醛酸 (C6H10O7 ),果胶酶,含游离醛基的糖于碱性溶液中，在碘的作用下被氧化成相应的一元酸。,过量的碘和氢氧根离子生成次碘酸根离子，当溶液呈酸性时，碘析出。,用硫代硫酸钠滴定剩余的碘量，计算出醛基氧化
14、时所消耗的碘量。,材料： (1) 1%果胶溶液：称量0.1 g果胶粉，加热水溶解，煮沸，冷却后过滤，定 容至10 ml (2) 配制0.1molL柠檬酸柠檬酸钠缓冲液(pH3.5) 甲液 称取柠檬酸1.05g,用水溶解并定容至50mL；乙液称取柠檬酸三钠1.47g ,用水溶解并定容至50mL ；甲乙两液以7：3的比例混匀, 调pH至3. 5 (3) 0.1 mol/L碘溶液：称量碘化钾1 g，溶于0.8 ml水中，另取碘0.508 g 溶于碘化钾溶液中，待全部溶化后定容至40ml (4) 果胶酶溶液：取0.1g果胶酶用10 ml柠檬酸柠檬酸钠缓冲液溶解 (5) 0.025 mol/L硫代硫酸钠
15、溶液：0.62g固体定容至100ml ，稀释20倍 (6) 1 mol/L碳酸钠溶液，0.53g Na2CO3固体定容至5ml (7) 2 mol/L 硫酸，取5.6ml硫酸溶液缓慢加到94.4ml水中,步骤 1.果胶酶活力测定实验步骤 （1）量取1%果胶溶液10 ml，实验组加入10 ml酶液，对照组加入10 ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。 （2）在50水浴2 h，取出加热煮沸1-2 min。 （3）冷却后，取5 ml反应液移入碘量瓶中，加1 mol/L碳酸钠1ml，0.1 mol/L碘液5ml，摇匀，暗处放置20分钟，加2 mol/L硫酸2ml，用 0.025 molL硫代硫酸钠滴定至淡黄色
16、。 （4）接着加0.5%淀粉指示剂1 ml，硫代硫酸钠继续滴定至蓝色消失 为止，记下所消耗的硫代硫酸钠ml数（A）。 （5）空白对照取混合液 5 ml同样进行滴定，记录所消耗硫代酸钠的 ml数（B）。,（6）计算 满足上述条件下，每小时酶促催化果胶分解生成1 mg当量游离 半乳糖醛酸定为一个酶活力单位，其中半乳糖醛酸的分子质量为194.14 。,？,本实验中果胶酶的酶活为,酶的活力= U/g(ml) 式中： A：样品滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数。 B：空白滴定所消耗硫代硫酸钠的毫升数。 N：硫代硫酸钠摩尔浓度。 0.5：1当量硫代硫酸钠相当于0.5当量半乳糖醛酸。 20：反应液总体积 51：酶液体积以1ml计 52：吸取反应液 n：稀释倍数 W：酶粉重量g或酶液体积ml,（3）果胶酯酶测定方法 （4）电泳转移胶膜法 （5）苹果汁脱胶分析 （6）黏度下降法 （7）还原糖测定法 （8）果胶裂解酶活性分析,毛霉与根霉最明显的区别是根霉有假根，孢囊梗与假根相对长出，单根或成簇，毛霉没有假根。 曲霉孢囊梗末端膨大，青霉不膨大,
