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1、RHO/ROCK通路在创伤性脑损伤后神经再生中的作用机制,研究方向：神经损伤与修复 专业：神经外科 研究类别：基础研究 项目来源：国家自然科学基金项目 导师：段虎斌 学生：崔刚,主要内容,立论依据 研究目标、内容、方法 拟解决关键问题、可行性分析 创新点 研究进度、预期成果 经费预算、参考文献,立论依据,创伤性脑损伤（TBI）致死、致残率很高，给社会家庭造成巨大损失。 在美国每年约有1，700，000人遭受TBI，其中约52，000人死亡，直接和间接经济损失达600亿美元。我国每年约有10万人死于TBI，其中，因车祸死亡约5万人，这一数字也呈上升趋势。,立论依据,本课题为国家自然基金项目-“创
2、伤性脑损伤的神经源性机制及其干预实验研究”的后续研究，着重讨论Rho/Rock通路在TBI后神经源性炎症和神经再生修复中的作用机制,探索新的干预措施，从新角度探求脑创伤后神经修复的新治疗策略和方案。,立论依据,本研究采用TBI大鼠模型，以脑组织内NF-B等为神经源性炎症反应的指标，脑细胞线粒体、神经突触等超微结构变化为神经病理损伤指标，Nogo-A等为阻碍神经再生的指标，BDNF等为促进神经再生的指标，探究该通路在调控神经再生中的作用机制,立论依据,机制假设：TBI激发神经源性炎症，激活Rho/Rock通路，致球蛋白轻链磷酸化酶（MLCP）活性受抑制，引起脑血管平滑肌收缩，血流下降，内皮及屏障
3、功能受损，导致脑组织缺血，阻碍神经再生，脑血管周围炎性物质渗出增加，引发血管性、细胞性脑水肿和脑细胞调亡。使用Rho激酶、NF-B抑制剂和神经营养因子等干预措施，松弛血管平滑肌，扩张血管，促进脑组织血供，改善神经再生微环境,这为TBI的早期干预和康复治疗提供了新思路。,图1 Rho/Rock经典信号通路,Rho/Rock信号通路的成分主要有三个：小G蛋白(在这里主要是指Rho)、与Rho相连的Rho激酶(Rho-kinase)和Rho-kinase的效应分子3-5。,研究目标,（1）探讨Rho/ROCK信号通路在TBI后神经源性炎症中的作用机制； （2）研究Rho/ROCK信号通路在控TBI后
4、中枢神经系统修复微环境的作用及其机制； （3）观察多种干预措施对Rho/ROCK信号通路的影响及其在治疗TBI中的应用价值。,（1）通过免疫组化和电镜观测Rho、ROCK、NF-B、BDNF、NOGO-A等在对照组（假手术组）及实验组（颅脑损伤动物模型组）SD大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及周边区脑组织中的分布特征和定位规律，以寻找组织学根据； （2）通过分子生物学手段（如PCR）测定对照组及实验组大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及其周边脑细胞中Rho、ROCK、NF-B、BDNF、NOGO-A等的基因表达水平。 （3）取大鼠大脑中动脉（MCA）做Rho激酶活性、MLCP活性
5、、MLCK活性及MLC磷酸化水平测定。 （4）观察干预措施（Rho激酶抑制剂）对上述（1）（3）变化的影响； （5）上述几项中改变和变化的相关性分析。,研究内容,（1）未干预TBI组：实验采用SD大白鼠（山西医科大学实验动物中心提供），体重270-290g，乌拉坦腹腔注射（1.2mgkg-1）麻醉满意后，将大鼠固定在脑立体定位仪上（ST-T型，日本成贸公司）。制作TBI模型时沿正中线切开头皮并剥离骨膜,切口长2cm，暴露右顶骨，牙科台式电钻(宁波医疗器械厂)于冠状缝后1.5mm,中线右旁2.5mm处钻一直径为5mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完整，将撞杆头端置骨窗处,击锤（重20g）沿外周导管分别从
6、10cm、30cm高处自由落下冲击撞杆,造成右顶叶轻、中度脑挫伤,另用击锤（重40g）沿外周导管从25cm高处自由落下冲击撞杆,造成右顶叶重度脑挫伤,致伤冲击力分别为0.028Ns、0.048 Ns和0.088 Ns，硬膜保持完整，骨蜡封闭骨窗。TBI组按损伤程度分为轻、中、重三组。于伤后0.5、6、12、24、48、72h断头取血，开颅取脑，进行如下实验：,实验方法,免疫组化和电镜观测Rho、ROCK、NF-B、神经营养因子、NOGO-A等在对照组（假手术组）及实验组（颅脑损伤动物模型组）SD大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及周边区脑组织中的分布特征和定位规律，以寻找组织学根据； 通
7、过分子生物学手段（PCR）测定对照组及实验组大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及其周边脑细胞中Rho、ROCK、NF-B、神经营养因子、NOGO-A、等的基因表达水平； 取大鼠大脑中动脉（MCA）做Rho激酶活性、MLCP活性、MLCK活性及MLC磷酸化水平测定。,实验方法,（2）干预TBI组：撞击鼠脑后使用Rho激酶抑制剂（Hydrochloride Fasudil、 Y-30141 ）、 NF-KB抑制剂-PDTC、神经营养因子等对TBI组上述3项改变的影响。各种干预措施（如 Rho激酶抑制剂-Y-30141 、NF-KB抑制剂）对神经损伤修复的影响（3）统计学分析 上述各项中改变和
8、变化的相关性分析。,实验方法,技术路线图,拟解决的关键问题 （1）大鼠大脑中动脉的分离，需要显微镜下仔细操作，技术要求高，我科实验室有实验用手术显微镜并有老师指导，仍需要不断练习，提高显微操作技能。（2）各种干预措施（如 Rho激酶抑制剂-Y-30141 、NF-KB抑制剂）对神经损伤修复的影响，国内外前期研究少，需要不断摸索实验条件。,4-氨基吡啶类（Y-30141）,异喹啉类（H-1152P）,（1）项目的设计构思是建立在以往工作基础上，是国家自然基金的后续深入研究，现已建立了稳定的实验动物模型和实验方法，并且已开展有关方面的研究，得到初步结果；（有前期研究基础） （2）本项目采用成熟的动
9、物模型，成熟的分子生物学、放射免疫学、病理学技术；（在方法学方面是可行的） （3）本人的指导老师和项目组成员有长期科研实践经验，为本课题提供技术和理论指导； （4）项目申请人所在学科有专用实验室，所在实验室和所在单位拥有课题相关的实验设备，导师课题经费充足， 实验动物及相关试剂均可购买到。（实验条件具备，可以确保实验如期完成）,可行性分析,（1）关于Rho/ROCK信号转导通路在TBI后神经源性炎症中的作用机制目前尚未见相关文献报道。 （2）关于Rho/ROCK信号转导通路在调控TBI后神经再生和功能修复微环境中的作用机制，目前尚未见相关文献报道。 （3）关于多种干预方法（Rho激酶抑制剂、N
10、F-KB抑制剂、NPY-受体阻抑、NK1-受体阻抑、干细胞细胞移植等）在颅脑损伤期对Rho/ROCK信号转导通路的影响机制，尚未见相关文献报道。,创新点,（1）2015年01月份2015年4月份：完成假手术组的免疫组化、电镜 和分子生物学实验。 （2）2015年5月份2015年8月份：完成颅脑损伤未干预组的免疫组化、电镜 和分子生物学实验。 （3）2015 年9月份2015年12月份：完成颅脑损伤干预组的免疫组化、电镜 和分子生物学实验。 （4） 2016 年1月份2015年3月份： 建立实验数据库，统计分析实验数据，总结课题，撰写论文，发表有关论文，准备论文交流与答辩。,研究进度,（1）Rh
11、o/ROCK信号转导通路在TBI后神经源性炎症中发挥重要作用，脑血管Rho激酶含量与脑组织NF-B表达水平之间存在相关性； （2）Rho/ROCK信号转导通路在调控TBI后神经再生和功能修复微环境中发挥枢纽作用，脑血管Rho激酶与促进和抑制神经再生的因子（如神经营养因子和NOGO-A）之间存在相关性； （3）Rho激酶抑制剂通过干预Rho/ROCK信号转导通路，对减轻TBI的严重程度、促进神经再生和功能恢复方面能起一定作用，为临床治疗TBI提供新思路和新方法。 （4）成果以论文形式发表,预期成果,经费预算,参考文献：,参考文献：,1. Traumatic Brain Injury in the
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