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1、神经母细胞瘤与FISH检测 FISH产品事业部,专注病理诊断产品的研发、生产与服务,page1,神经母细胞瘤,概述 流行病学 临床分期 常用检测方法 FISH检测的靶点及意义,page2,概述,神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)又称成神经母细胞瘤,是威胁儿童生命的多见的恶性肿瘤之一,据文献报告它在儿童恶性肿瘤中排列第四位. NB是从原始神经嵴细胞演化而来,交感神经链、肾上腺髓质是最常见的原发部位,恶性程度高,预后差.,page3,Izbicki T，Mazur J,Izhicka E，et a1Epidemiology of neuroblastoma：analysis of a
2、 single institutionAnticancer Res，2003，23(2)：19331938,流行病学,NB是儿童最常见的颅外实体瘤,占所有儿童肿瘤的8%10% 约75%的NB患者在5岁以下 96%的病例10岁前发病,3.5%在10-20岁发病 男性女性比例24 ：1 年发病率0.3-5.5/10万Izbicki T,eta Epidemiology of neuroblastoma:analysis of a single institution.Anticancer Res,2003,23(2C):1933-1938,page4,NB的INSS国际临床分期,page5,常用的
3、检测方法,组织病理学检查:HE染色蛋白质组检测：免疫组化（IHC）,page6,page7,鉴别诊断，指导预后判断都有困难,寻找新的方法,NB有关的癌基因,NB细胞的细胞遗传学研究，证实约80病例出现染色体异常表现。 1p缺失，主要发生缺失是1p36区段 MYCN基因扩增和蛋白过表达 11q缺失，主要发生缺失是11q23区段 MDM4基因扩增和蛋白过表达 .,page8,分子生物学检测,反转录-聚合酶反应技术（RT-PCR） southern印迹杂交（southern blot) 聚合酶链式反应-杂合型缺失（PCR-LOH） 荧光原位杂交(FISH),page9,反转录-聚合酶反应技术（RT-
4、PCR）,RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术;首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段.,RNA提取,反转录（RNA-cDNA）,PCR扩增,电泳,显示结果,southern印迹杂交,page11,聚合酶链式反应-杂合型缺失（PCR-LOH）,原理：通过PCR扩增DNA某多态位点来确定该位点的杂合 性缺失（Loss of Heterozygosity）即PCR-LOH.,page12,检测方法比较,page13,FISH - Fluorescence In Situ Hybridization,一项快速
5、、准确、高灵敏度的细胞分子生物学技术在恶性肿瘤相关基因/染色体区域的大片段缺失、扩增、转位等方面具有重要诊断价值是常规分子诊断技术的重要补充,page14,FISH 技术原理,荧光原位杂交Fluorescence In Situ Hybridization原理 采用体外荧光标记的DNA探针，利用探针与被检测的目的基因碱基互补配对的原则，探针与目的基因经高温变性杂交后，通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从而检测细胞，组织样本中的染色体或基因异常。,page15,FISH 技术原理,page16,NB中FISH检测的靶点,SRD基因缺失检测探针,MYCN基因扩增检测探针,page17,MDM4
6、基因扩增检测探针,MLL基因检测探针,page18,NB中FISH检测的靶点,1p缺失,、期NB中80100有1p缺失,与临床预后差、生存期短相关,是NB的特征基因改变之一.1p36的缺失一般都是杂合型缺失（LOH）.1p缺失的主要区段发生在1p36.3,它的缺失是NB易复发的因素之一,1p36区上含有肿瘤抑制因子CHD5.,J Natl Cancer Inst 2008;100:940949 Oncogene (2005) 24,26842694,page19,1p36.3缺失（FISH阳性）,荧光原位杂交 (FISH)检测1p36.3缺失 SRD基因缺失检测试剂盒,正常型 （FISH阴性）
7、,page20,MYCN基因,定位于2号染色体2p24区段的原癌基因. 25%以上的NB患者出现MYCN基因扩增. MYCN基因扩增和过度表达与NB的浸润,转移和不良预后密切相关, MYCN基因拷贝数增多在NB中较早期（I、II、IVS期）多见. MYCN基因扩增每单倍基因组大于10个拷贝被认为是预后不良的标志.,page21,陈霞静儿童神经母细胞瘤36例诊断分析右江民族医学院学报，2003，25(2)：225-226Clin Cancer Res 2009;15:2085-2090,page22,FISH检测结果中：MYCN基因的扩增形式有两种一种在均质染色区扩增（HSR）一种是双微体扩增（
8、DMs）,荧光原位杂交 (FISH)检测MYCN扩增 MYCN基因扩增检测试剂盒,page23,NeoplasiaVol.3,No.2,2001,pp.105-109,FISH阳性的检测结果,FISH阳性（DMs）,FISH阳性（HSR）,page24,FISH阳性判断标准,红色众多信号连接成簇（扩增表现为均质染色区） 红色信号出现双微体扩增 红绿信号比1.5,page25,MDM4基因,定位于1q32区段 是p53上游重要的调节因子 MDM4扩增或/和过表达在65%的NB中出现 可作为NB肿瘤的特异性化疗靶点 可成为肿瘤潜在的治疗靶点,Jin G,Cook S,et a1.HDMX regu
9、lates p53 activity and confers chemoresistance to 3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosoureaNeuro Oncol,2010,12:956-966国际遗传学杂志20112年4月15日第35卷 第二期,page26,11q缺失,11q缺失在原发性NB中出现 在未出现MYCN扩增的NB恶性进展过程中，出现定位于11q23.3（MLL）失活（扩增或者缺失）,N Engl J Med 2005;353:2243-53,page27,FISH检测靶点的临床意义,page28,FISH技术在NB诊断中的应用，使疾病的诊断从肉眼,到
10、细胞学,再到基因异常（分子水平）不断完善.各种检测方法的有效结合,能更好的提高敏感性和特异性,诊断结果更靠,对NB临床诊断、预后判断和指导治疗都重要意义.,page29,谢谢,Cancer Res 2008;68:(8).April 15,2008,CHD5是1p36区上的一种蛋白,CHD5通过p19ARF/p53信号通路调控细胞的增值、衰老和凋亡,是一种很强的肿瘤抑制基因,NB细胞系CHD5启动子发生甲基化,导致CHD5表达缺乏或低表达,导致肿瘤细胞恶性增殖. 研究表明,CHD5基因的甲基化状态与肿瘤的无事件生存率和总体生存率有关.,均质染色区（Homogeneously staining regions,HSR）,均质染色区扩增是指扩增的DNA片断位于染色体内，形成大段的基因组区域，染色体显带染色时在正常区带之外的一段均匀染色区域.,双微体（double minutes,DMs）,双微体是指扩增片断游离于染色体外，可见为双球形小体，也叫点状假染色体.,P53,p53是一种抑癌基因；p53蛋白是DNA损伤的关键因子，过表达使细胞死亡，表达减少或缺失则导致肿瘤的发生. MDM4扩增或过表达可导致p53蛋白的失活.,
