人类胎盘促乳激素与人类促乳激素穿插嵌合重组蛋白

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1、人類胎盤促乳激素與人類促乳激素穿插嵌合重組蛋白 對人類促乳激素接受體 結合能力與抗乳癌相關機制之研究,藍珮菁 Pei-Ching Lan 張正教授 Advisor: C.Allen Chang National Chiao Tung University Biological Science and Technology,研究背景 胎盤及胎盤素,中國的漢方醫學寶典本草綱目中，對於乾燥胎盤 -紫河車有記載 胎盤是母體傳遞胚胎生長發育所需物質的通道 前四週發育快速 胎盤素之功效，廣為生醫界所研究，其具有幫助細胞新生、及增強免疫機能等功效 風濕性關節炎,研究背景 胎盤及胎盤素,研究背景 胎盤促乳激素

2、（Placenta Lactogen）與促乳激素(Prolactin),胎盤促乳激素（Placenta Lactogen, PL） 22.3kDa蛋白質 只由胎盤生產 初期了解可促進母體乳腺之生長與乳汁之生產。 促乳激素(Prolactin, PRL) 腦下垂體前葉所分泌 22.5kDa蛋白質 在生產後調控乳汁中之酪蛋白(casein)與乳蛋白素(lactabumin)之製造以及乳汁分泌。,研究背景 促乳激素與訊息傳遞,JAK-STAT pathway,Ras-MAPK pathway,研究背景 促乳激素與訊息傳遞,oPL/PRLR x-ray structure,研究背景 胎盤促乳激素（Pl

3、acenta Lactogen）與促乳激素(Prolactin),訊息傳遞: JAK2 kinase-STAT路徑、ras-MAPK路徑 最近一些研究報告指出，促乳激素會影響thymic stromal cell的 IL-1與IL-6的表現量，進而影響T細胞的分化。IL-6在體外試驗上也表現出抑制鼠的胎盤促乳激素的分泌量。顯示促乳激素與細胞動素亦有關連，但其機制尚不清楚。 最近的研究顯示促乳激素與乳癌有其相關性,研究背景 乳癌與乳癌用藥,乳癌在國人及世界婦女癌症中，一直佔有很高的比例。 乳癌：乳房乳腺管細胞或是腺泡細胞經由不正常分裂、繁殖所形成之惡性腫瘤。 乳癌的治療：開刀、放射線治療、化學治

4、療與荷爾蒙療法,研究背景 乳癌與乳癌用藥,化學治療藥物：fluorouracil（5-FU）與anthracycline(ex. doxorubicin)為第一線藥物 荷爾蒙療法：以對抗動情激素接受體(estrogen receptor)的藥物為主，如tamoxifen。 衛生署藥政處通過用於治療乳癌的新藥： 化學療法：太平洋紫杉醇 （Taxol）、歐洲紫杉醇 （Taxotere）、滅癌平（Navelbin）與截瘤達（Xeloda） 荷爾蒙療法：安美達（Arimidex）。,研究背景 乳癌與乳癌用藥,目前對乳癌的荷爾蒙療法主要是以對抗動情激素接受體(estrogen receptor，ER)的

5、藥物為主-無法完全抑制乳癌細胞的成長。 Tamoxifen 亦會抑制由促乳激素引發的 ER-negative Nb2 rat lymphoma cells的生長。-ER以外的receptor 在一些報告中指出促乳激素(PRL)可能為對抗乳癌的另一個目標。 會過量表現促乳激素的基因轉殖鼠在11至15月齡即出現乳癌腫瘤PRL有影響 經由蛋白質水解酵素水解的促乳激素片段，可表現出有抑制血管新生的作用PRL有影響,研究背景 乳癌與乳癌用藥接受體,PRL對抗乳癌的接受體研究： Dopamine receptor 但由最近的研究報告指出其與乳癌的相關性小，所以抑制Dopamine receptor對治療乳

6、癌可能是無效的 。 PRL receptor： PRL 專一結合，抗乳癌接受體目標 PL、GH 也會與PRL receptor binding PLPRLGH,研究背景 擬解決問題,針對PRL receptor研究抗乳癌藥物 利用PL與PRL特性研發不產生生理功用的蛋白質 蛋白質片段：成分複雜不易控制 嵌合重組：可掌握蛋白質性質,研究背景 基因隨機的嵌合重組,相關的基因做隨機的嵌合重組，可以得到多樣化的新型基因，而成為一組新蛋白質的基因庫。 Gene shuffling為一快速產生chimerical library的方法。,利用DNase I 將相似的gene做隨機的剪切成小片段，再以此小片

7、段基因的互補做PCR，可隨機的將基因相連而成互相鑲嵌的新的基因。由於鑲嵌的順序隨機且互不相同，分析新的基因庫，可以獲得更多的蛋白質資訊，並且可以由特定目標的篩選而得到功能更佳的基因及蛋白質。,研究背景 基因隨機的嵌合重組,研究背景 基因隨機的嵌合重組,將hPL、hPRL做隨機的gene shuffling，藉由鑲嵌而成的基因序列，可分析這一family的蛋白質的結合作用、coding potential、tissue specificity 跟gene function，藉由DNA sequence 以及computer modeling，可比較不同蛋白質之結構與性質的關係。 而藉由此蛋白質與

8、PRL 接受體的競爭力分析，及進一步的細胞動素分析，可作為抗乳癌藥物之candidate或是乳腺發育不全的治療。,工作項目及實施方法 1.人類促乳激素接受體(hPRL receptor)基因分子選殖,為了進行重組促乳激素的篩選，本實驗室必須有促乳激素接受體基因以表現其蛋白質。,工作項目及實施方法 2.人類促乳激素(hPRL)之基因分子選殖與蛋白質表現,為了進行重組促乳激素的篩選，以及測試將來進行shuffling重組時的PCR條件，本實驗室亦進行促乳激素基因選殖，並可將其表現之蛋白質與市售隻促乳激素蛋白質加以比較。,工作項目及實施方法 3.hPL與 hPRL gene shuffling,0.

9、005U DNase I 剪切hPL與 hPRL geneRT 10-30min 9510min ice 10min1.4agarose電泳 200-500bp,primeless PCR Primer PCRCloningvectorE.colishuffling library DNA sequence,工作項目及實施方法 4. Shuffling gene與hPRL 結構之分子模擬,利用電腦程式,如Rasmol、insight II 將已選殖出之hPRL receptor gene進行電腦模擬，加上PRL之模擬結果，以得到兩蛋白質互相作用之模式。 模擬各Shuffling gene之三級

10、結構,比較其蛋白質結構，並由模擬預測可能之功能性,如與receptor之結合位置。,工作項目及實施方法 5. Shuffling gene與hPRL receptor之結合力試驗,Yeast two-hybrid system是近年發展的蛋白質交互作用研究方法。 以yeast two hybrid 的方法，以hPRL receptor為釣餌，找出與hPRL receptor有交互作用的Shuffling gene hPRLR gene - pGBKT7 vector shuffling gene - pGADT7 vector yeast表現出轉錄活化之表型 如lacZ基因表現而使加入X-ga

11、l培養之菌體產生藍色 Essential gene 存活,工作項目及實施方法 Shuffling gene與hPRL receptor之結合力試驗,其利用將釣餌蛋白的基因剪接入一帶有DNA binding domain基因之現載體，以產生釣餌蛋白與DNA binding domain之融合蛋白；另外候選之library基因則剪接入一帶有轉錄活化因子基因之載體，以產生候選蛋白與轉錄活化因子之融合蛋白 當此兩種選殖載體均被轉型入酵母菌內，若釣餌蛋白與候選蛋白產生交互作用，則DNA binding domain會與酵母菌內之DNA結合，轉錄活化因子則促使標示基因表現，如此則可以挑出可與釣餌蛋白質交互

12、作用之候選蛋白質。,工作項目及實施方法 6. Binding constant,Yeast two hybrid： 定性 藉由ELISA方法測定重組蛋白質與接受體的結合常數。 另一個篩選的方法：可以將shuffling的protein點於晶片上，再利用帶有標示的receptor protein，來將與hPLR有交互作用之蛋白質篩選出。 參考各文獻的方法，以gel filtration 來分析與hPRL receptor之競爭力。 對hPRL receptor有較大競爭力者，可能為抗乳癌藥物 candidate。,工作項目及實施方法 7. NMR/X-Ray蛋白質結構測定,將與清華大學余靖教授合

13、作進行NMR測試 與中研院袁小含博士合作進行X-Ray測定重組蛋白質的分子結構。,工作項目及實施方法 8. Clinical studies,篩選出可能有功用之重組蛋白質後，將再以乳腺細胞株做in vitro assay。 以特定乳癌老鼠進行animal model試驗。,9. hPL之細胞動素(cytokine)變化,乳腺細胞株與hPL或重組蛋白共同培養之，測定cytokine 如IGF-1、IL量之變化或其他cytokine量之變化。,目前研究結果 1. DNA shuffling試驗,先前的試驗，試以不同濃度DNaseI與不同作用時間的搭配，尋找出可以適當剪切DNA為不同大小片段的條件。

14、 最後以以0.005U的DNase I剪切DNA，室溫作用10分鐘，可得到較佳的剪切情況，最小片段可由電泳膠片上看出約200bp。,200bp,目前研究結果 1. DNA shuffling試驗,而在將DNA片段重新組合的PCR試驗，則先以Taq聚合脢做試驗，但卻無法正確生合成所要的DNA。 後經參考paper上以辨識度較高的聚合脢做效果較好，則改以rTth聚合脢做重組的PCR，則可得到重組的DNA。,目前研究結果 1. DNA shuffling試驗,Shuffle重組的DNA library，經酵素剪切，接入cloning vector 來載入shuffling之基因，再轉型入 E.col

15、i 中。 經過DNA初步定序，發現有二個重組DNA可能是有變化的。分別命名為pSPRS314-2-2與pSPRS314-3-3b46,目前研究結果 2. TLC與HPLC分析,突變株TKRMY68及對照之野生株CBY57(無CAS基因) 以SD培養液培養3天後，收集菌液，萃取其不皂化之脂類物質 經TLC分析，可明顯辨識出TKRMY68會產生一新的環化物質。,目前研究結果 2. TLC與HPLC分析,以HPLC分析，OSD 4.6x250mm管柱，CH3CN 1ml/min沖提，UV202偵測 突變株TKRMY68的萃取物於大約25分鐘時較野生株CBY57的萃取物多了一個peak。,目前研究結果

16、 3. PRL基因選殖,PL基因已由林孟嘉同學於本實驗室選殖出。 PRL基因則參考基因庫裡的DNA序列設計引子，欲以PCR放大的方法來選殖。 hPRL(I)-30BamHI :5-CGCGGATCCAACATGAACATAAAGGATCG -3 hPRL (II)-24EcoRI :5-CCGGAATTCCTTCTGATACATTTCCTGCAG -3 hPLR(II)-30KpnI :5-CGGGGTACCGTTACCTGAAGAAAAATCACA -3 以super Therm聚合脢做PCR，由瓊脂膠體電泳確認，已經由placental cDNA放大選殖出PRLR基因。 選殖入pBluescript II SK+ vector，經轉型入XL1Blue E. Coli，萃出其plasmid，以EcoRI限制酵素剪切，由瓊脂膠體電泳可見約3kb相當於vector大小及約2kb相當於insert大小的DNA片段。,