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1、,The 3rd Affiliated Hospital Of Southern Med. Univ.,染色体的常用检测方法,林凯桑,传统细胞遗传学技术 染色体的显带技术快速染色体异常检测( RAD) 技术 荧光原位杂交技术(FISH)分子核型技术 比较基因组杂交技术(CGH) 微阵列-比较基因组杂交技术（-CGH）,基本概念,核型（karyotype）： 一个体细胞（somatic cell）中的全部染色体称为核型。确切的说核型是指是一个体细胞内的全部染色体按其大小和形态特征排列所构成的图像。 对这种图像进行分析称为核型分析。 在细胞周期的有丝分裂中期，染色体的形态结构比较稳定，一般所描述的
2、染色体的形态结构都是中期染色体。,染色体的正常核型,丹佛 (Denver) 体制 1960年人类染色体研究者在美国丹佛市聚会制定的人类有丝分裂染色体标准命名系统。 规定每一条染色体可通过相对长度、臂率和着丝粒指数三个参数予以识别。 常染色体按长度递减的次序以122号编号，性染色体则称为X和Y。另外人类的46条染色体根据长度递减顺序和着丝粒位置划分为7个易区分的组，即以字母AG表示7组染色体，并决定将副缢痕和随体作为识别染色体的辅助指标。,染色体显带,对有丝分裂中期染色体进行酶解，酸、碱、盐等处理，并用特殊的染色方法可使染色体在其长轴上显出一个个明暗交替或染色深浅不同的横纹，这样的横纹就叫做染色
3、体的带。分类: 整条染色体的显带技术 染色体局部的显带技术,染色体显带核型,染色体显带Q带：荧光染料 氮芥喹吖因(QM)G带：胰酶GiemsaR带：经处理的标本Giemsa or Acridine Orange G带的反带C带：Y染色体 着丝粒 副缢痕T带：染色体末端结构异常N带：AgNO3Giemsa, 随体和NOR,1.Q带（Q banding）：,Q显带用芥子喹吖因（QM）或盐酸喹吖因（QH）等荧光染料对染色体标本进行染色，然后在荧光显微镜下进行观察。 但Q带保存时间短，而且需要在荧光显微镜下进行观察，因而，限制了Q显带技术的应用。,染色体标本用热、碱、蛋白酶等预处理后，再用Giemsa
4、染色。在光学显微镜下，可见Q带亮带相应的部位，被Giemsa染成深带，而Q带暗带相应的部位被Giemsa染成浅带。这种显带技术称为G显带。 G显带克服了Q显带的缺点，G带标本可长期保存，而且可在光学显微镜下观察，因而得到了广泛的应用，是目前进行染色体分析的常规带型。 G带在各条染色体上显出的带型和Q带型基本相同,2.G显带（G banding）：,正常男性染色体 46, XY,正常女性染色体 46，XX,G显带核型分析,所显示的带纹与G带的深、浅带带纹正好相反，故称为R带。G带浅带如果发生异常，不易发现和识别，而R显带技术可以将G带浅带显示出易于识别的深带，所以R显带对分析染色体G带浅带部位的
5、结构改变有重要作用。,3.R显带（R banding）：,人类1号染色体Q、G、R三种显带对比图,专门显示着丝粒的显带技术。C显带也可使第1、9、16号和Y染色体长臂的异染色质区染色。因而，C带可用来分析染色体这些部位的改变。,4.C显带（C banding）：,C显带核型,5. T显带（T banding）：专门显示染色体端粒的显带技术，用来分析染色体端粒。 6. N显带（N banding）：专门显示核仁组织区的显带技术。 7. 高分辨显带对染色体的分析达到了亚带（subband）的水平，能够确认那些更为微小的染色体结构改变。,几种显带的制作方法之间的关系,染色体显带技术的优缺点,染色体显
6、带是细胞遗传学分析技术中不可替代的基本方法。“金标准” 操作简便，经济 可以提供核型的完整图像 影响因素： 染色体相似性很强，复杂畸变时；或畸变微小（如缺失5Mb)，不足以引起图像明显变化时，结果分析困难。 耗时（培养需72小时）且依赖于获得良好的分裂相，而有的标本中分裂指数低，或染色体形态学表型差。,传统细胞遗传学技术 染色体的显带技术快速染色体异常检测( RAD) 技术 荧光原位杂交技术(FISH)分子核型技术 比较基因组杂交技术(CGH) 微阵列-比较基因组杂交技术（-CGH）,原位杂交是用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸中的互补序列杂交,从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位
7、和相对定量分析。,原位杂交,1）同位素原位杂交70年代 2）非同位素原位杂交80年代中后期 免疫酶联 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)同位素原位杂交的不足： 1）不稳定；2）高背景；3）曝光时间长；4）结果统计学处理繁琐；5）同位素的使用和处理,荧光原位杂交技术(FISH),1986年Pankel在原位杂交基础上，将放射性同位素标记改用非放射性同位素即荧光素标记探针而建立了技术。利用该技术，可以精确地把一DNA片段定位到某条染色体的特定区带上。FISH检测不需要进行细胞培养，是临床遗传学检测的有效补充手段。,原理：通过观察荧光信号
8、在染色体上的位置来反映相应基因的情况。,利用FISH技术诊断Down综合征,图示：利用21号染色体特异性探针对一位高龄妊娠妇女进行产前诊断，未培养的羊水细胞进行荧光原位杂交, 显示所检测的细胞均有3个杂交信号,经选择性人工流产后确诊为Down综合征患儿。,FISH与传统技术的比较：,传统的染色体检查方法：周期长，人工消耗大，而且染色体分析需要有较好质量的中期分裂相。肿瘤细胞中期分裂相不易获得，而且有些重要预后意义的累及基因位点的微缺失或仅存在于间期细胞中的异常，传统的细胞遗传学技术是不能检测出来的。 荧光原位杂交技术：不需要中期分裂相，因此可分析大量间期细胞，且具有操作相对简单、重复性好、敏感
9、性和特异性高的优点。在同一标本上，可同时几种不同探针，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向，空间定位精确；可以检测隐匿或微小的染色体畸变以及复杂核型。 只能检测已知位点的染色体异常，失去了核型分析的宏观性。,传统细胞遗传学技术 染色体的显带技术快速染色体异常检测( RAD) 技术 荧光原位杂交技术(FISH)分子核型技术 比较基因组杂交技术(CGH) 微阵列-比较基因组杂交技术（-CGH）,比较基因组杂交（CGH）,是由Kallioniemi等在1992年首先提出的，是检测整个肿瘤基因组DNA增加或减少的强有力的工具。原理：在荧光原位杂交基础上，结合消减杂交技术而发展起来的技术，主要用于肿
10、瘤的检测及其基因组分析。由于它的高分辨率先逐渐被用于遗传疾病的检测中。,比较基因组杂交原理示意,采用肿瘤患者的基因组DNA和正常人的基因组DNA作为探针，与正常人的中期染色体分裂相进行杂交。比较两种探针所标的荧光信号的强度比率来判断肿瘤患者的DNA是否存在缺失、增加或复制。,等比混合,比较基因组杂交（CGH）,优点： 快捷检测中期、间期基因组 不需预先知道DNA发生改变的部位 一次实验即可检出待测样本整个基因组拷贝数的增减 缺点： 精度有限, 对微小的扩增或缺失检测不出, 仅适用于对整个基因组进行筛查。CGH也无法发现平衡染色体易位。,微阵列比较基因杂交（CGH）,1998年，在CGH基础上发展了微阵列-比较基因杂交技术（CGH）。 可检测全基因的发生畸变 DNA需求量很少，操作简单，结果稳定快速等 费用昂贵,其他新技术,多色荧光原位杂交（M-FISH） 多色荧光染色体显带（Rx-FISH） 染色体光谱核型比对分析技术（SKY) .,
