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1、端粒、端粒酶与肿瘤,东南大学医学院病理学系,端粒与端粒酶-端粒的概念,端粒（telomere）是真核生物染色体线性DNA分子末端的特殊结构，对维持染色体稳定性和DNA完整复制具有重要作用 。,端粒与端粒酶-端粒的发现,20世纪30年代末：Mller首先提出了“端粒” 概念20世纪70年代: Olovnikov 提出染色体分子末端的丢失 细胞退出细胞增殖1978年Blackbum,et al. 发现四膜虫端粒分子末端是重复 串联的5 GGGGTT 3 DNA简单序列1985年Gueider,et al. 发现端粒酶1989/1992年间Lundblad,et al. 提出“端粒假说”,端粒与端粒
2、酶-端粒假说的内涵,细胞分裂 次数增加 端粒缩短 端粒缩短启动某些信号细胞停止分化和老化(M1期) 病毒转化/P53突变 细胞继续分裂,端粒进一步缩短 细胞 进入M2期 细胞死亡 端粒酶激活 端粒功能恢复 细胞永生化,端粒与端粒酶-端粒的组成和结构,端粒是染色体上增大的末端染色体粒 原端粒（protelomere）常端粒（utelomere）电镜研究显示，端粒含有不规则折叠染色质丝，每根纤丝直径约23nm，这种纤丝很少在染色体一端终结，而是弯回到染色体中去。,端粒与端粒酶-端粒的组成和结构,Blackburn等发现四膜虫rRNA分子末端是一连串重复的六核苷酸，序列为：3CCCCAA 5， 5G
3、GGGTT 3 这种重复一般可达几十次，总长度为370bp-520bp。1986年Zalian等在纤毛虫中发现了与端粒DNA结合的特异性蛋白（TRF1、TRF2），其分子质量分别为55kd、41kd的二聚体蛋白质，结合在富含G的端粒DNA链上。象“帽子”一样保护端粒不受化学修饰或核酸酶的作用。端粒的这些结构蛋白与端粒酶有区别。细胞学观察端粒直/间接与核膜相连，可能与染色体分离和细胞分裂有关。,端粒与端粒酶-端粒的功能 (1),端粒DNA和它的结合蛋白紧密结合，像二顶帽子盖在线性DNA的两端 使其末端具有惰性 保持着遗传的稳定性。,端粒与端粒酶-端粒的功能(2),端粒保证了染色体末端稳定的复制。
4、按线性DNA分子的复制模型，在新复制的DNA链的5-端将有一缺隙无法填补，细胞面临5-端逐渐缩短。端粒的存在能减缓这一缩短趋势，使染色体近末端的遗传信息不致在复制中丢失。,端粒与端粒酶-端粒的功能(3),Fussel曾报道用3H-T对洋葱根尖细胞进行脉冲标记，发现在G1、S、G2期，染色体的走向都和分裂末期的染色体一样，着丝粒异染质聚集于核的一边，而端粒则位于着丝粒的对侧，成散在分布。据推测这种与核膜的紧密结合关系，维持着细胞染色体的空间定向，使染色体所携带的信息能有秩序而又有效的复制和表达。,端粒与端粒酶-端粒酶的发现,1984年Shampay等在研究酵母染色体的端粒结构时发现端粒的复制是一
5、种无模板复制。此后，Blackburn实验室利用四膜虫的无细胞抽提物在体外进行了端粒“加尾”实验，结果发现：端粒的加尾方向是按富G链的5端3端，每次是以TTGGGG为一个单位重复加上这种“加尾”是无模板的反应体系中有一种物质能特异性识别拟被加尾的末端序列催化反应的是一种具有酶活性的蛋白质，称为端粒转移酶,端粒与端粒酶-端粒酶的结构,该酶系核糖核蛋白复合物 蛋白质 酶活性RNA 复制模板不同物种的端粒重复序列不同-保守性较差四膜虫的模板区序列： 5，-CAACCCCAA-3，人的模板区序列： 5，CUAACCCUAAC-3，模板区 与端粒的末端结合定延伸复制的模板,端粒与端粒酶-端粒酶的结构,发
6、现四膜虫端粒酶是一种RNA-蛋白质复合物（RNP结构），分子质量在200kd-500kd，对RNA酶极为敏感，端粒酶内的RNA和蛋白质对其活性似乎都是必需的端粒酶的蛋白组分由一些亚单位构成，如端粒酶催化亚单位（TERT），其共同特点含有逆转录酶的大部分保守性序列。,端粒与端粒酶-端粒酶的功能,细胞分裂 端粒缩短端粒酶端粒亚单位合成 端粒延长,端粒与端粒酶-端粒酶的功能,根据端粒DNA以及端粒酶的特性提出了端粒延长的“爬行”模型（inchworm model）。端粒合成必须有3个步骤： 端粒酶对已有的末端的识别和结合； 根据内含的RNA模板添加互补的核苷酸并聚合 移位使端粒重复序列得以连续复制。
7、 端粒酶能够对端粒DNA的富含G-链进行加尾延长，而富含G-链又能通过G-G配对使其终端形成回折，这样DNA复制时新链5-端缺失就可以得到补齐,端粒与端粒酶-端粒酶活性的测定,起初是通过间接测定不同组织类型染色体中端粒的平均长度变化来估侧端粒酶活性。1994年报道了端粒重复序列扩增法（telomeric repeat amplification protocol, TRAP）以检测端粒酶活性。该方法的特点： 提取物制备：用去污剂而不是用低张法溶细胞以端粒酶催化引物延伸反应的产物作PCR的模板，通过寡核苷酸引导的DNA合成和链的分离不断循环，使端粒酶反应产物成指数式的扩增，其灵敏度比常规分析法的
8、高104倍,端粒与端粒酶-端粒酶与细胞生长,染色体端粒DNA长度的恒定：端粒增长（端粒酶合成） 缩短（细胞分裂时DNA复制 )端粒酶基因低表达端粒DNA序列会逐渐变短 细胞变得衰老细胞的死亡,端粒与端粒酶-端粒酶与细胞生长,Herley等在未转化的、培养的人成纤维细胞中发现 端粒的长度随分裂次数的增加而缩短； 其端粒长度与细胞的年龄呈负相关； 体细胞的端粒长度大大短于生殖系细胞。高等真核生物端粒很长，如人胚细胞约10kb；低等动物如纤毛虫不超过100bp，与之相对应的是，正常哺乳动物体细胞中端粒酶活性低甚至缺乏，而低等真核生物中则有高活性的端粒酶以维持染色体的稳定。此外，端粒的长短还和细胞分化
9、程度相关，分化程度越高，端粒DNA越短。如人胚细胞端粒平均长度10kb，人精细胞9kb，而一般正常体细胞只有4kb,端粒、端粒酶与肿瘤 （1）,许多研究表明，在基因突变、肿瘤形成时，端粒可表现出缺失、融合和序列缩短等异常现象。B细胞淋巴样白血病端粒融合易位型染色体在大部分肿瘤 染色体端粒缺失和端粒融合。端粒融合的占20%-30%，而且融合可在任何染色体上随机出现。环形染色体可由端粒联合而形成，通过产生染色体融合类型的亚克隆可引起染色体不稳定，并最终导致环形染色体的丢失。,端粒、端粒酶与肿瘤 （2）,近年来发现，在结肠癌、乳腺癌等肿瘤中，端粒序列长度明显缩短。端粒序列缩短可能是导致肿瘤形成的一种
10、分子水平的改变，是肿瘤细胞的一种标志。无限增殖的细胞如Hela细胞，有极高的端粒酶活性，这也许是因为短端粒与某些致癌因素协同刺激，使细胞生长趋势加强。正常体细胞和正常衰老细胞中几乎没有端粒酶的活性，而有些恶性细胞中却有很高的端粒酶活性。,端粒、端粒酶与肿瘤 （3）,端粒酶为何能促使癌症的形成？（ 1990 ）细胞增殖 端粒变短 ？ 激活端粒酶 细胞死亡 细胞永生化,端粒、端粒酶与肿瘤 （4）,有人提出这样一种假设： 体细胞的增殖 端粒缩短 当端粒缩短到一个阈值水平 某些信号 阻止细胞进一步分裂. 如果有促发癌的遗传突变阻止这种安全信号的发送，或者因各种原因致这些信号未被细胞接受，那么细胞将越过
11、正常的衰老进程 继续分裂 获得细胞的永生化特征。,端粒、端粒酶与肿瘤 （5）,要揭示端粒与肿瘤的关系，须回答的问题 端粒的不断缩短是否导致细胞衰老？ 激活端粒酶使细胞的端粒稳定，能使细胞无限制地 分裂？ 关键的问题是必须阐明恶性细胞的端粒酶何时和如何被激活，是其RNA组分抑或是蛋白质组分决定端粒酶活性？ 活性是在转录前抑或在转录后起作用？ 肿瘤发生过程中的哪一个阶段端粒酶被激活？,端粒酶在肿瘤诊断中的应用（1）,近年的研究结果表明：恶性肿瘤组织端粒酶的检出率高达84%-95%， 良性瘤和正常组织的端粒酶检出率仅为4%左右头颈扁平细胞癌：Mao等检测了16株头颈扁平细胞癌细胞株，均有端粒酶活性；
12、26/29例浸润性头颈扁平细胞癌有端粒酶活性； Mutirangura检测了14/16例头颈扁平细胞癌端粒酶呈阳性。,端粒酶在肿瘤诊断中的应用（2）,肺癌：Hiyama等检测了136例原发肺癌和68例癌旁非恶性组织，原发癌细胞端粒酶阳性率为80%，正常癌旁细胞阳性率为4.4%。端粒酶的活性反映了肺癌细胞恶变的程度，小细胞肺癌的恶性程度要高于非小细胞肺癌，因而端粒酶具有高活性和高检出率。肝癌：Miura检测了12例带有丙肝病毒、12例带有乙肝病毒、4例未带病毒的肝癌组织及周围慢性肝炎和肝硬化组织端粒长度，缩短的程度依次为慢性肝炎、肝硬化和肝癌细胞。肝癌细胞均有端粒酶活性。,端粒酶在肿瘤诊断中的应
13、用（3）,胃癌：Hiyama等检测了66例原发胃癌标本，85%为端粒酶阳性；15%为阴性，这其中有8例是早期患者。癌旁组织端粒酶阳性率为6% 将端粒酶阳性和端粒酶阴性两组相比较，发现： 与年龄、性别、组织学、浸润深度无差异 与瘤体大小，恶性度、有无转移有相关性 与生存期有负相关性 端粒酶（-）超过70%， 端粒酶（+）仅为30%。,端粒酶在肿瘤诊断中的应用（4）,胰腺癌：Hiyama检测43例胰腺癌，95%有端粒酶活性；11例良性瘤均无活性，13例胰腺炎中仅有1例阳性。结肠癌：Yoshida等检测了35例结肠癌，95%（32/35）有端粒酶活性，对应正常组织阴性率为86%（30/35），其余1
14、4%为弱阳性；表明端粒酶是良好的肠癌检测指标。 肾癌：Mehle等检测了56例肾癌标本，端粒酶阳性率为71%，对应的正常组织无端粒酶活性。,端粒酶在肿瘤诊断中的应用（5）,前列腺癌：Sommerfeld等检测出21/25例前列腺癌组织端粒酶为强阳性；4例淋巴结转移前列腺癌也是强阳性。正常和良性增生未检出端粒酶活性。25例前列腺癌旁增生组织仅有3例有弱酶活性。端粒酶活性和端粒长度可以作为区别正常、良性增生和恶性前列腺组织的指标。膀胱癌：Yoshida检测了56例膀胱癌，端粒酶阳性率为86%（48/56），17例非癌膀胱病灶均无酶活性，2例异常发育尿道病灶有端粒酶活性。表明端粒酶活性可能出现在癌变
15、的早期，有望成为检测早期膀胱癌的指标。,端粒酶与肿瘤治疗（1）,端粒酶存在于许多的癌症组织中抑制端粒酶 肿瘤细胞端粒丧失杀死肿瘤细胞,端粒酶与肿瘤治疗（2）,端粒酶抑制剂治疗肿瘤的特点：特异性、广谱性目前这类研究已引起关注，尚有许多问题须解决 ？必须确定哪种正常细胞产生端粒酶，同时还必须评估端粒酶对于这些细胞的重要性。 ？证明端粒酶的抑制剂是否能够如预期的那样破坏端粒酶阳性的肿瘤。,端粒酶与肿瘤治疗（3）,？ 为了研究开发抑制人体内端粒酶的药物，还必须弄清楚这种酶究竟如何发挥功能，怎样结合到 DNA上，如何决定添加端粒亚单位的数目。在核中的DNA布满着各种各样的蛋白质，包括某些特异地与端粒结合的蛋白质。控制端粒酶的活性是否与端粒DNA序列结合的蛋白质起作用，改变它们的活性是否会破坏端粒延长，这一系列的问题都是在今后的研究中须要解决的。,端粒酶与肿瘤治疗（4）,有人认为：有可能寻找到端粒酶的生物学抑制剂。细胞杂交研究表明，表达端粒酶的细胞与没有端粒酶活性的细胞互相融合产生的杂交细胞，细胞寿命受到限制。这种显性效应提示，体细胞可能表达一种端粒酶活性的抑制剂或阻遏物。弄清这种阻遏物的作用部位及其机制，最终可将抑制端粒酶的作用用于疾病的治疗。,
