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1、LAMP技术对猪呼吸道主要病原诊断的建立与应用,学院：动物科技学院年级：2009级 姓名：夏伟,研究意义,猪支原体性肺炎是由猪肺炎支原体引起的一种慢性肺炎，还称作猪地方流行性肺炎，Mare、Switzer和Goodwin等在1965年分别从患肺炎猪的肺组织中分离出其病原，经过试验后成功复制了本病，将此病原被命名为M.hyopneumoniae。到目前为止，猪支原体性肺炎都被养猪业人士看做是重要疫病之一，它可能会造成重大经济损失，发生频次较高，而且该病流行最广，是最难预防的。本病虽然发现的很早，但是近年来还是由于经常发生，发生的方式是与PRRS、圆环病毒等其它病原引起猪的混合感染，并且对养猪业造
2、成重大的经济损失。,研究意义,猪传染性胸膜肺炎是一种接触性呼吸道传染病，是感染猪胸膜肺炎放线杆菌而引起的。主要的临床特征包括急性出血性纤维素性胸膜肺炎和慢性纤维素性坏死性胸膜肺炎。猪胸膜肺炎放线杆菌Actinobacilluspleuropneumoniae(App)的血清型现在大概有12种，其中有一些毒力较弱且不具有致病性，其他一些则会引起严重的疾病。检测后毒力很强的是1、5、9、11和12型，而毒力温和的是3、6型。胸膜肺炎放线杆菌寄生在上呼吸道和扁桃体。病原的传播途径主要是通过飞沫或气雾在短距离内传播，胸膜肺炎放线杆菌在体外只能存活几天。,研究意义,猪巴氏杆菌病（swine pasteu
3、rellosis）又被称作猪肺疫、猪出血性败血症，俗称为“锁喉风”，是一种因感染多杀性巴氏杆菌而引起的传染病，败血症为该病急性型的主要特征，临床症状包括咽喉部出现急性肿胀，病猪呼吸困难；急性型的主要临床特征是出现纤维素性胸膜肺炎；而慢性型的临床症状并不明显，一般表现为慢性肺炎、关节炎和胃肠炎等，而且病猪逐渐消瘦，国内的猪群主要是散发性的感染。近些年来，我国集约化养猪业发展迅速，进而猪群感染巴氏杆菌的报道也逐渐增多。,研究意义,在黑龙江地区的规模化养猪场，疾病控制一直是十分棘手的问题，特别是猪的呼吸系统疾病呈蔓延扩大态势，发病率较高，死亡率在5%15%或以上，猪的各个日龄阶段均存在呼吸道疾病的危
4、害。呼吸系统疾病除直接造成死亡损失外，还因饲料报酬大大降低，继发感染等而造成治疗费用升高，给集约化猪场和养猪户造成严重的经济损失。把LAMP技术运用对猪病进行早期快速诊断和流行病学调查意义重大。同时对规模化猪场的发病情况进行流行病学调查，根据黑龙江省规模化猪场实际制定有效的综合防病措施，减少因呼吸道疾病给猪场带来的损失。,研究内容,猪呼吸道疾病的流行病学调查,采集的病例主要来自黑龙江省不同地区的18个猪场，每个猪场采取了不同的病料数，并且了解记录了猪场内猪只的发病情况。,猪呼吸道疾病的流行病学调查,采用血清学和PCR分子生物学检测方法检测病原菌,猪呼吸道疾病流行病学调查,黑龙江省各地区猪场猪呼
5、吸道疾病流行病学调查柱状图,猪呼吸道疾病流行病学调查,经过统计，在黑龙江地区的养猪场，90的猪场都有猪的呼吸道综合症的发生，在黑龙江屠宰场时有发现有肺炎病变的猪肺。猪场爆发猪呼吸道综合症后很难清除，它除了造成直接死亡之外，更为严重的是使猪增重缓慢，饲料利用率减少，出栏时间推迟，并长期携带多种相关病原体。有些猪场PRDC的发病率可达40%-80%，直接死亡率在20%以上，增重下降或生长停滞的可达70%，有的猪场甚至被迫将该阶段的猪全部淘汰。很多呼吸道综合症的病原体所引发的临床症状极为相似，很难通过临床症状做出正确的诊断。有些疾病（如猪蓝耳病）已经不能表现出其临床的特异性症状，有些病原体还有相当长
6、的潜伏期。因此更加难以做出准确的诊断。血清学诊断虽然能在一定程度上做出确诊，但时间较长，难以满足现场需要。因此，研究出能够同时对多种病原进行诊断的方法势在必行。同时对规模化猪场的发病情况进行流行病学调查，根据黑龙江省规模化猪场实际制定有效的综合防病措施，减少因呼吸道疾病给猪场带来的损失。,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,引物设计与合成,猪支原体、猪胸膜肺炎放线杆菌、 猪巴氏杆菌基因组的提取,LAMP 诊断方法反应条件的优化,实验方法,PCR扩增及鉴定,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,重组质粒的鉴定结果,pMD18-T-Mh载体PCR鉴定结果 1-2：扩增Mh基因；3
7、-4：扩增App基因；5：扩增Sp基因；6：阳性对照；7：阴性对照 1-5: The PCR identification result of the pMD18-T-Mh、pMD18-T-App、pMD18-T-Sp plasmid6: The positive control; 7: The negative control,M 1 2 3 4 5 6 7,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,LAMP 检测方法反应条件的优化,猪肺炎支原体内外引物的优化,外引物不同浓度下电泳结果 1-4的浓度：0.1 pmol/L、0.15 pmol/L、0.2 pmol/L、0.25 pmol/
8、L； 5：阳性对照6：阴性对照,M 1 2 3 4 5 6,M 1 2 3 4 5 6,内引物不同浓度下电泳结果 1-4的浓度：0.4 pmol/L、0.5 pmol/L、0.6 pmol/L、0.7 pmol/L； 5：阳性对照6：阴性对照,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,猪放线杆菌内外引物的优化,外引物不同浓度下电泳结果 1-5的浓度：0.1 pmol/L、0.15 pmol/L、0.2 pmol/L、0.25 pmol/L； 5：0.3 pmol/L；6：阳性对照,M 1 2 3 4 5 6,M 1 2 3 4 5,内引物不同浓度下电泳结果 1-4的浓度：0.4 pmol/
9、L、0.5 pmol/L、0.6 pmol/L、0.7 pmol/L； 5：阳性对照,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,猪巴氏杆菌内外引物的优化,外引物不同浓度下电泳结果 1-4的浓度：0.1 pmol/L、0.15 pmol/L、0.2 pmol/L、0.25 pmol/L； 5：阴性对照,M 1 2 3 4 5,内引物不同浓度下电泳结果 1-3的浓度：0.4 pmol/L、0.5 pmol/L、0.6 pmol/L； 4：阴性对照,M 1 2 3 4,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,dNTP+浓度的浓度的优化,M 1 2 3 4 5 6 7,dNTP+不同浓度下电
10、泳结果 1-4 的浓度：0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L；5：阳性对照；6-7：阴性对照,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,Bst DNA 聚合酶用量的优化,M 1 2 3 4 5 6 7 M,不同Bst DNA聚合酶下电泳结果 1-5的体积：3 U、4.8 U、6.4 U、8 U、9.6 U；6：阳性对照；7：阴性对照,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,MgSO4 浓度的优化,MgSO4不同浓度下电泳结果 1-5的浓度：2.5 mmol/L、3.75 mmol/L、5 mmol/L、6.25 mmol/L、7.5
11、mmol/L; 2.10：阳性对照；7：阴性对照,M 1 2 3 4 5 6 7,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,优化后建立 LAMP 检测方法,LAMP 扩增反应体系,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,猪支原体肺炎特异性检测,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M,特异性检验电泳结果 1：阳性对照；2：支原体肺炎；3-8：多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、 肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌；9：阴性对照,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,多杀性巴氏杆菌特异性检测,M 1 2 3 4 M,特异性检验电泳结果 1：肺炎双球菌；2：副
12、猪嗜血杆菌；3：多杀性巴氏杆菌4：阴性对照,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,猪胸膜肺炎放线杆菌特异性检测,M 1 2 3 4,特异性检验电泳结果 1：阴性对照；2：肺炎双球菌3：副猪嗜血杆菌；4：猪胸膜肺炎放线杆菌,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,敏感性检验结果,M 1 2 3 4 5 6 M,不同模板浓度下电泳结果 1-5的浓度： 10-5、10-4、10-3、10-2、10-1；6：10-6,猪呼吸道疾病的主要病原检测LAMP方法的建立,试验中以支原体肺炎、多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌基因组为模板，通过对内外引物的比例、dNTP+ 浓度、Mg2 + 浓度和
13、Bst DNA聚合酶用量等条件逐一优化。在1.2的琼脂糖电泳结果表明：其内、外引物的体积分别为1.0L、0.4L，其dNTP+的体积为1.0L，其Bst DNA聚合酶的体积为1L，MgSO4 的体积为3L，整个试验仅需约1h左右，比一些常规的方法时间上要短，在这个条件下能够得到较为特异的目的梯状条带，与常规PCR 反应相比，大大缩短了检测时间。并且LAMP的反应结果是一种梯状的条带，与肺炎双球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和链球菌相比，LAMP分析结果能够特异性的鉴别猪肺炎支原体，该方法表现出了很高的可靠性，且操作简单。LAMP方法检测多杀性巴氏杆菌和猪胸膜肺炎放线杆菌比常规方法检测及血
14、清学检测时间要缩短很多，而且明显增加了检测的敏感性和准确性。 从结果中表明可以成功建立了肺炎支原体、放线杆菌和巴氏杆菌的LAMP诊断方法，为我们国家临床上诊断支原体肺炎、放线杆菌和巴氏杆菌提供了灵敏有效的分子生物学的方法 。,LAMP方法的现场应用及综合防治措施的制定,猪肺炎支原体的防制措施： （l）做好猪场环境卫生工作：定期对猪场内进行卫生清扫和消毒工作。采取自繁自养的原则，避免引进种猪或仔猪时从外地或其他猪场引进，特别是购猪的车辆进入厂区必须经过严格消毒才能进入。 （2）加强饲养管理：严格注意猪舍内部的温度，预防突发情况，注意猪舍内通风顺畅，时刻保持猪舍空气新鲜。冬季每天查看猪舍是否有漏风
15、，夏季注意降低猪舍内的温度。做到合理的饲养密度：保育舍23头/m2；育肥舍0.8头/m2；一个饲养小组应该在1013头猪。饲养使用全价饲料，这样可以提高猪的抵抗力，同时定期进行驱虫。 （3）做好疫苗预防：在仔猪出生721天，注射支原体活苗，通过免疫接种有效地预防和控制支原体肺炎。这样对预防支原体肺炎具有显著效果。 （4）药物控制：定期在饲料中添加某些药物是预防支原体肺炎的重要手段。药物有：土霉素、四环素、大环内脂类、替米考星、林克霉素、泰妙菌素、氟苯尼考、恩诺沙星、泰乐菌素、强力霉素等对支原体都有较好的预防效果。,LAMP方法的现场应用及综合防治措施的制定,猪巴氏杆菌病的防制 （1）对于本病的
16、预防要制定合理的免疫程序，及时预防接种。目前主要使用猪繁殖与呼吸综合症灭活疫苗和猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗进行接种。蓝耳病疫苗在仔猪45日龄进行首免，每头肌肉注射2毫升。首免后一个月可用相同剂量的疫苗加强免疫一次，后备母猪在70日龄前同仔猪一样免疫。怀孕母猪在分娩前一个月加强免疫一次，剂量为每头4毫升。种公猪在70日龄前接种同仔猪一样免疫，以后每隔6个月免疫一次，剂量为每头4毫升。要注意的是已经发病的猪和屠宰前21天的猪不宜接种。猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联苗在接种蓝耳病疫苗后7天给予接种。苗猪在阉割时接种，每头1毫升，转群或出售时再用同样剂量免疫一次。公猪每隔6个月免疫一次，每头3毫升。母猪在苗猪阉割时接种，每头3毫升。 （2）对混合感染的病例，建议联合使用抗菌和抗病毒药物。可用青霉素、链霉素、土霉素、强力霉素、头孢类药、环丙沙星、氟苯尼考等药物交替使用。对体温升高的重症病例，在使用抗生素的同时，可在饮水中加入适量的多种维生素、葡萄糖、氯化钾、钠等补液，以维持机体的内环境稳定。有条件的猪场可用干扰素、高免血清、免疫球蛋白等药物进行特异性治疗。也可用中药方剂清热败毒散，拌料饲喂，有一定疗效。,
