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1、红树植物基因多态性分析,海洋药学教研室,了解不同分子标记原理和方法，掌握RAPD技术原理和整体流程； 了解基因组DNA提取原理，掌握植物基因组DNA提取原理和方法； 熟悉PCR技术原理，了解PCR技术的改进应用； 掌握核酸电泳技术和原理； 熟悉相关生物软件和仪器的使用； 锻炼整体实验设计的思路，了解研究过程中的结果分析手段。,实验目的,不同种类、不同的生态环境下生长的植物体内的化学成分不同的现象： 如 药材的道地性 贝母：川贝和浙贝桔生淮南为桔，移于淮北为枳,化学多态性 chemical polymorphism,生物种群中存在的与等位基因相关的若干种表现型。 ABO血型 肤色等,多态性,在一
2、个生物群体中，同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型（genotype）或等位基因（allele），亦称遗传多态性或基因多态性。 基因多态性一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域。 对于一个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔定律世代相传。,基因多态性 Genetic Polymorphism,DNA位点多态性 site polymorphism 长度多态性 length polymorphism,基因多态性的表现,宏观角度 种属差异 环境因素基因结构与功能角度 复等位基因（multiple allele） 同一基因座出现的多个基因，形成系列称为复等位基
3、因 为数众多的复等位基因，是某些复合体（HLA）高度多态性的最主要原因 共显性（condominance） 一对等位基因同为显性，称为共显性 共显性大大增加了种群中某些基因表型的多样化,基因多态性的形成,形态学标记 Morphological marker 外部形态特征，如植物的矮秆、紫鞘、卷叶等 细胞标记 Cytological marker 染色体的核型(染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等) 带型(C 带、N 带、G带等) 分子标记 molecular marker 蛋白分子标记 利用蛋白质的多态性来反映不同品种的差异，如同工酶、等位酶等 DNA分子标记 通过对品种DNA的多态性即D
4、NA碱基序列的差异进行分析，从而鉴别不同品种。,遗传标记 Genetic marker,极大的丰富性； 多态性高，变异类型丰富； 大多数DNA标记是共显性的，很容易区分杂合体和纯合体； DNA标记对性状的表达没有影响； DNA标记具有高度稳定性，不受环境条件和个体发育影响，无组织或器官特异性，准确性、稳定性和重复性较高；,DNA分子标记的优点,限制性片段长度多态性 Restriction Fragment Length Polymorphism（RFLP） 随机扩增多态DNA Random Amplified Polymorphic DNA（RAPD） 扩增片段长度多态性 Amplicatio
5、n Fragment Length Polymorphism Analysis（AFLP） 微卫星技术 Microsatellite DNA 单核苷酸多态性 Single nucleotide polymorphism （SNP）,DNA分子标记研究方法,由于DNA 的多态性，导致DNA 分子中限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，所产生的片段数目和每个片段的长度不同，即限制性片段长度多态性。 这种多态性可通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种或个体间DNA水平的差异（即多态性），通过多个探针的比较则可以确立生物的进化和分类关系。 广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位及生物进
6、化和分类的研究。,RFLP,以一系列不同的随机排列的寡聚核酸单链为引物，对所研究的基因组DNA 进行扩增，扩增产物通过电泳分析，检测扩增产物的多态性；扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。 RAPD 技术现已广泛用于品种鉴定、系谱分析及进化关系研究。,RAPD,利用PCR检测酶切产生的特异片段，结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。,AFLP,微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列； 每个重复单元的长度在110bp之间，不同数目的核心序列呈串联重复排列（SSR，Simple Sequence Repeats ），而呈现出长度多态性
7、。 每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。 各SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，,微卫星技术,单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的，当其中的一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变，而空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受到排阻力大小不同。 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以特异性将构象上有差异的分子分离开。,单核苷酸多态性（SNP）,RAPD技术原理,基因组中存在众多反向重复序列，每一随机引物进行PCR的过程中，单一引物可
8、与反向重复序列结合，使重复序列之间的区域得以扩增。而引物结合位点DNA序列的改变以及扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，可通过电泳检测而显示出DNA片段的多态性。 RAPD技术继承了PCR技术的优点，可在所研究的物种没有任何分子生物学基础下，对其进行DNA多态性的分析。 所需样品量少，灵敏度高，效率较高。,技术小结,模板制备（DNA提取） PCR扩增 琼脂糖电泳检测PCR产物 数据分析 进化树构建,RAPD技术流程,基本仪器设备：台式高速离心机、移液器、水浴锅、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、紫外分光光度计、微波炉等 生物材料： 不同属植物 试
9、剂和酶：石英砂、缓冲液A、消化液（含1.5% SDS）、KAc、酚/氯仿/异戊醇、异丙醇、RNase A、随机引物、Taq DNA聚合酶、琼脂糖、TAE缓冲液、DNA上样缓冲液等,实验材料,保证DNA结构的完整性 纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染,基因组DNA提取,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后乙醇沉淀水相中的DNA。,经典的SDS法,称取植物树叶0
10、.5g，加入石英砂和1.5ml缓冲液A（临用前加入50l -巯基乙醇）中快速研磨； 叶片磨碎后加入3 ml缓冲液A，12000rpm离心5min。 去除上清，将沉淀悬浮于0.7ml的1.5%SDS消化液（65预热，临用前加入50l -巯基乙醇）中， 65水浴40min消化，间或混匀； 加入1/3体积5M KAc（pH7.0），混匀，冰浴30min，12000rpm离心5min； 取上清，加入等体积酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提，12000rpm 离心5min； 上清转管，加入等体积氯仿抽提，12000rpm离心5min；,SDS提取植物基因组提取,上清转管，加入等体积异丙醇轻轻混匀，1
11、2000rpm 离心5min，沉淀溶解于300l无菌双蒸水中，加入2l RNase（10mg/ml）37保温30min，消化RNA； 在总体系中加入300l无菌双蒸水，然后加入等体积酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提，12000rpm 离心5min； 上清转管，加入等体积氯仿抽提，12000 rpm 离心5min，上清转移至一洁净1.5ml eppendorf管中； 加入等体积异丙醇，混匀后，12000 rpm离心10min，沉淀用无水乙醇洗涤2次，80乙醇洗涤一次，沉淀晾干后，加入50l无菌水溶解，获得DNA溶液。 1.0琼脂糖电泳检测DNA质量。,SDS法提取植物基因组,红树植物多糖含
12、量较高，可能严重影响后续试验。通过用缓冲液A对植物组织进行预处理，预先去除大量的多糖，以达到提取高纯度DNA的目的。 巯基乙醇的作用：由于植物中含有大量多酚类物质，容易与DNA形成不溶性沉淀，造成DNA的损失；此外多酚类物质是氧化性物质，在溶液中形成氧化环境，易引起DNase对DNA的降解，在溶液中加入巯基乙醇以形成还原性环境，避免DNase的作用。 酚-氯仿抽提：酚是有效的蛋白质变性剂，可以去除蛋白，但核酸提取过程中常采用酚和氯仿的混合液，这是因为：两种不同有机溶剂较之单一使用一种效果更佳，而且可以避免酚造成的核酸损失。接下来，在使用酚-氯仿后需用氯仿再次抽提主要是为了防止溶液中痕量酚对于后
13、续操作中酶的影响。,相关知识：,硅膜吸附法原理,硅膜吸附法流程,植物组织（细胞）磨碎后经裂解液裂解；蛋白质、多糖、细胞残片被沉淀去除；然后基因组DNA在高盐状态下选择性吸附于硅膜，再通过一系列漂洗离心步骤, 进一步将多糖、多酚和细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅膜上洗脱下来。 简化了繁琐的有机试剂抽提步骤，减少了环境污染和操作损失，操作要求低，重复性好； 彻底去除可能抑制后续操作的抑制物（如乙醇、有机溶剂），提高产物稳定性； 高效快速，易于自动化；,基于细胞裂解的膜吸附法,RB1 (Resuspension Buffer 1) 重悬缓冲液 重悬并裂解细胞，变
14、性核蛋白体，释放核酸 RNase A RNA酶A 降解RNA，去除RNA干扰 PB1 (Precipitation Buffer 1) 沉淀缓冲液 沉淀细胞碎片、蛋白、多糖等杂质 BB1 (Binding Buffer 1) 结合缓冲液（已加入乙醇） 作用于核酸表面水化层，通过电荷作用力促进核酸结合于硅膜 CB1（Clean Buffer 1）清洁缓冲液 去除未能结合于硅膜表面的杂质、盐分等 WB1（Wash Buffer 1）漂洗缓冲液（已加入乙醇） 去除以弱离子力结合的杂质、盐分等，消除高盐环境，纯化产物 ddH2O(无菌双蒸水) 洗脱核酸制备管（含硅质膜） 收集洗脱废液,试剂盒组成,取新
15、鲜植物组织100mg 在研钵中加入液氮充分碾磨成细粉； 转移细粉至一个1.5ml 离心管，加入250l 缓冲液 RB1和15l Rnase A ，旋涡振荡，充分混匀以助裂解； 55水浴15分钟，在水浴过程中颠倒离心管 2 -3 次，混合样品； 12000 rpm离心5min，轻轻吸取上清至另一洁净1.5ml离心管； 加入100 l 缓冲液 PB1，充分混匀，冰浴 5 分钟， 12000 rpm 离心5 min，小心吸取上清至一新的1.5ml 离心管，避免扰动和吸取界面物质； 加入375 l缓冲液BB1，充分混匀；（加入BB1可能出现絮状沉淀，但不影响 DNA提取） 取全部混合液（包括可能的沉淀
16、）加入吸附柱中，（吸附柱放入收集管），1 2 000 rpm 离心30 sec，弃去收集管中废液； 吸附柱容量有限，先加 650l 溶液离心，弃废液，再加入剩余的溶液，再次离心,植物基因组提取步骤,在吸附柱中加入500l 清洁液CB1，12,000 rpm 离心30sec，弃废液； 在吸附柱中加入500l 漂洗液WB1，12,000 rpm 离心30sec，弃废液；并重复本步骤一次；将吸附柱放回空收集管中，12,000 rpm 离心2 分钟，彻底去除残留的WB1，以免其中残留乙醇影响后续操作； 取出吸附柱，放入一洁净1.5ml离心管中，在吸附膜的中间部位加100l 双蒸水（事先在 60水浴中预热）， 室温放置1分钟，12000 rpm 离心1 分钟，获得基因组DNA溶液； 取5l DNA溶液，以1.0%agarose 电泳检测，剩余DNA 保存于-20中，作为PCR扩增模板；,植物基因组提取步骤,基因组DNA质量可通过琼脂糖电泳初步检测： 基因组DNA片段应在20kb30kb之间； 高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象。,
