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1、如何构建质粒克隆周鸿雁2011.06.15连接Bax基因至EGFP载体怪彰连接助入Bg酶加余怡加人EcoR腐刊信命T一E酶切)1目的基因两侧加入酶切位点BaxpCMV-Sport6偷焘:无苣光:GFP、Dsred无标签:Flag、HA、MycpCMVSPORT6MCSee-vrpeeeeesm。一一怀-一5sceputtiesateoeienguoacopitttezoeoeniieeetoetCoroeuespeauetszpogtsepaeex心nn一面顶面面ses恩一一ftorugmcyyitypnmriizepnpoiernwnereeimeyTeantfRv力诊ennGene:BAX
2、MGC:20956,IMAGE4578562Insertsite:,EcoRlXhol构建过程灯设计引物(增加酶切位炉,BgT,EcoRI)、目的基因PCR,双酶切载体(BglI,EcoRI)琼脂糖凝胶电泳DNA胺回收(基因,载体)双酶切目的莲团(B盅IFBEDR)目的基因与载体相连DH5a转化鉴定第一步:设计目的基因PCR引物目的:1)通过PCR方法投增目的基因2)在目的基因片断两端增加酶加位点文酶切位点旁需加入保护碳基设计引物前需解决的问题炜1、选择酶切位点受2、选择保护碱基坚3v终止密码子PEGFPMCSa口心心心口心心心诈坪诊stocliulostedotun喵m邱ls【c【口餐uC【
3、$卯廓盯谴肛疃施谴旧砂许65ht+度标矮Ea友一文g儡l。ciyeenenoeencnsneuemenaueng选苷浩别猴入位点:个两个酶切位点间隔远2、目的基图序列中无相应酶刃位点3、酶刊缓冲液一致BAXinsertsequence。atggacgggtccggggagcagcccagaggcgg99ggcccaccagctctgagcagatcatgaagacaggggcccttttgcttcagggtttcatccaggatcg2gcagggcgaatgggg9999ag9cacccgagctggccctggacccggtgcctcaggatgcgtccaccaagaagctgagcga
4、gtgtctcaagcgcatcg99gacgaactggacagtaacatggagctgcagaggatgatt。gccgccgtggacacagactccccccgagaggtctttttccgagtggcagctgacatgttttctgacggcaacttcaactggggccgggttgtcgcccttttctacttgccaqcaaactggtgcicaagdcectgigcaccaaggtdcoggaactgatcagaaccatcatgggctggacattggacttcctccgggagcggctgttgggct99atccaagaccagggtggttgggacggcctcctctoctactttgggacgcccacgtggcagaccgtgaccatctttgtggcgggagtgctcaccgcctcactcaccatctggaagaagatgggctga园丽园逊逊河证病诊胺0城芮廷堪宝谴葳吊s辜噩_魉【雇6山誓c谌旺鑫s魉墓C鬓侵鬣_皿霉毽“口蟹墨4nH尘_着d-El1广l_I】见FgP怀A诊enzymeBAXbafferSal10|xhol1234EcoR101234Tnfit1Bg03Pst10BdlT0DNAStar软件-MapDraw功能
