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1、叶绿体的分离与荧光观察,讲课人： 曹 颖高 慧王 婧,实验目的,1、通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。 2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。,实验原理,细胞器分离过程包括两个阶段：破碎细胞和细胞组分的分离 在等渗溶液中进行组织匀浆、分离叶绿体的分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行 叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心 利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光（次生荧光）,常用的细胞破碎方法,离心分离技术,离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同
2、离心力、不同介质中沉降分离。 分离各种细胞组分的方法主要有：差速离心密度梯度离心速率-区带梯度离心等密度离心,差速离心,采用逐渐提高离心速度或低速和高速交替进行离心，使各种沉降系数不同的颗粒在不同的离心速度及不同的离心时间下分批分离的方法。 操作过程中一般是起始离心速度较低，让沉降系数较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍悬浮在上清中。收集上清，改用较高转速离心，将较小颗粒沉淀。以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。 方法较简单，但分辨率不高。沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开。,密度梯度离心,用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或
3、离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。分为速率-区带梯度离心和等密度梯度离心。 一次离心可分离提纯样品中几种组分，用于较精细的分离。,两种密度梯度离心方法的异同,差速离心与密度梯度离心的区别,差速离心是用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离；密度梯度离心中单一样品组分的分离是借助于混合样品穿过梯度层的沉降或上浮来达到的； 差速离心要用两个甚至更多的转速，而密度梯度离心只有一个离心转速； 差速离心适用于分离混合样品中各沉降系数差别较大的组分，而密度梯度离心可分离的物质密度差异较小。实际操作中，差速离心和密度梯度离心相结合可以达到更精确的分离。,荧光显微镜观察荧光现象,某些物质在一定短波
4、长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能荧光现象立即停止。 有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光，如叶绿体的火红色荧光。 有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为间接荧光，如叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。,荧光染料：吖啶橙,吖啶橙是一种与DNA和RNA都能结合的荧光染料 在紫外光或蓝光（330-485nm）激发下，DNA可被激发出530nm的发射荧光（细胞核发亮绿色荧光），RNA可被激发出640nm的发射荧光（核仁和胞质RN
5、A发橘红色荧光） 产生两种不同荧光是由于吖啶橙与双链DNA和单链RNA的结合方式和结合量不同决定的。它与DNA结合是嵌入双链之间，结合量相对少而与RNA的结合则由静电吸引堆积在磷酸根上，结合量相对较多。 推测：叶绿体次生荧光的由来，大部分来自叶绿体的吸附作用，极少部分来自叶绿体中的RNA。,加入吖啶橙后叶绿体的自发荧光（火红色）消失了？原因：荧光淬灭现象所致。吖啶橙是一种芳香杂环离子型染料，可透过细胞膜。推测吖啶橙阳离子是进入叶绿体膜内通过影响叶绿素分子结构或所处的化学环境使自发荧光淬灭的。 荧光淬灭现象产生的原因：分子结构和化学环境使影响物质发射荧光和荧光强度的重要因素（pH、温度、光、淬灭
6、剂）,荧光染料：吖啶橙,实验用品,材料： 新鲜菠菜 试剂： 0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange) 仪器：普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜 、烧杯、量筒、滴管、离心管、试管架、纱布、无荧光载片和盖片等,实验步骤,新鲜菠菜叶片（去叶脉）30g 0.35 M NaCl 150ml，组织捣碎机低速匀浆（5000rpm）35min（破碎细胞） 匀浆液 6层纱布过滤 滤液1000rpm离心2min 弃沉淀，上清液3000rpm离心5min 弃上清液，沉淀为叶绿体（混有部分细胞核） 0.35 M氯化钠溶液悬浮 滴片观察 取1滴叶绿体悬液置于载玻片上，加盖
7、玻片后分别用普通光学显微镜观察叶绿体的形态结构和荧光显微镜观察自发荧光 取1滴叶绿体悬液，滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，加盖玻片后荧光显微镜观察间接荧光,叶绿体的分离与荧光观察,菠菜叶手切片观察 新鲜菠菜叶，刀片切出一斜面置于载玻片上 滴加12滴NaCl溶液 盖上盖片 显微镜下观察,注意事项,叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35M NaCl）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。 分离过程最好在0-5的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察，控制好离心速度和时间。 离心机使用：离心管要平衡 弃上清时不要把沉淀荡起，再加NaCl溶液时（少加，以免叶绿体太稀不易观察）用滴管吹匀混合液，力
8、气不能过大，以免造成叶绿体破碎。 荧光显微镜使用 荧光显微镜检要在光线尽量暗的环境下进行 不要直接观察激发光源，保护眼睛 荧光染料有一定得毒性，要做好防护 观察荧光受多种因素的影响，如温度、光、淬灭剂等 在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照 制作荧光装片最好使用无荧光载片、盖片和无荧光油 汞灯开启后15min内不要关闭,实验结果,普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。 菠菜叶手切片在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞、保卫细胞、叶肉细胞。叶肉细胞呈长方形或类方形，内含大量带有绿色的叶绿体颗粒，后者呈单一或多个排列。另外，视野下还可见到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。 荧光显微镜下，选用蓝色激发滤光片，叶绿体自发荧光为火红色；吖啶橙染色后间接荧光为橘红色，细胞核呈绿色，气孔仍为绿色。 荧光显微镜下，叶肉细胞中叶绿体的荧光强度要比游离叶绿体弱。,作业,根据显微观察结果，绘制菠菜叶的结构模式图。 叶绿体分离的实验原理是什么？在分离叶绿体时应注意些什么问题？,
