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1、浙江大学硕士学位论文山药多糖提取工艺优化及结构分析姓名：吴丹申请学位级别：硕士专业：遗传学指导教师：李永泉20040601摘 要山药(D幻5co陀口凸d加尬J DPcmP)，又名白苕、土薯、大薯、薯药，营养丰富，具有很高的药疗价值。本草纲目记载：山药性温、味甘平、无毒，健脾胃、益肺肾、涩精止泻；山药还具有抗衰老、抗氧化、提高应激力、增强免疫力、降血脂、抗肿瘤、抗突变等功效，山药中起到药疗作用的主要成分是山药多糖。本文主要研究山药多糖的提取工艺、分离纯化及多糖的结构分析。提取工艺主要考虑浸提水溶液温度、pH值、料水比和浸提时间对多糖得率的影响，研究最佳的粗多糖浸提工艺参数；首先进行单因素试验，在
2、此基础上采用正交实验进行分析，进而采用中心组合设计进行中试，最后经统计软件matlab编程进行多元线性回归分析得到山药粗多糖较优化提取工艺为：pH值为913，料水比为l：55，浸提温度85左右，沉淀时酒精浓度70，离心转速1900g，所提取的粗多糖含纯多糖为20。分离纯化从山药入手，脱除蛋白质与酒精沉淀后，采用 离子交换树脂DEAE一52和SephadexGloo进行分离，结果得到中性和酸性两种不同性质的多糖，中性多糖和酸性多糖颜色均为为纯白色。气相色谱分析表明：山药中性多糖主要由鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖组成，其组成比例为8：16：25：10，酸性多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、
3、半乳糖组成，其组成比例为7：3：11：19：18。高效液相色谱分析可知中性多糖和酸性多糖的分子。量分别为15598D和21500D；红外分析可知中性多糖和酸性多糖分别含有吡哺糖和Q糖苷键构型。浙江大学坝i学位论文professionalstatistical softwareThe optimal extractingprocedure was pH913，山e ratiobetween脚terialand water 1： 55 ，under thisconditionsthepolysaccharide purity in cnlde is 20For purificationof poi
4、ysaccharide，the protein should be remorVed士rom thesupematant，then the polysaccharide was precipitated again with ethanol atthe concentration of 70F01lowing，ionexchange column DEAE一52and Sephadex G一1 OO colunm chromatography were used as the 1aststepof isolationAt last two main po】ysacchande electrif
5、emuspolysacchandeand nonelectriferOus polysaccharide were separated f0Hn theDi()sc()蹭c!扫俄8觏s Decmg， which can be used for stnlcture an出ysisGas chromatogram analysis showed that the electriferous polysaccharidewas made up of，nonelectriferous polysacchar主de was made up of，HPLCanalysis testified the mo
6、Iecular weight of eIectriferous polysaccharideand nonelectriferous polysacch砸de are 15988 and 21500D，infaredspectnlm showed that elec讲ferous polysaccha矗de is epirrIers91ycosidic bond，nonelectriferous polysacch撕de is pyraJloseThis research wo血would establish a strong basement for theapplications of D
7、iojco坩口扫以加mJ DPcmP polysaccharide in drug indust彤and also point out the efficient way to industrialized ex廿act of Di。占他。白以施ms D已cm已polysaccharideKey words： DioscD地口6口搬纪s D已cm已polysaccharide pufificationseparation stmcture analysis optiInization6浙江人学颂士学位论文分子量测定常用的方法有层析柱法和高效液相色谱法。赵国华等人以Dextran系列标准品的分子
8、量与对应的洗脱体积作标准曲线，再根据多糖的洗脱体积求得分子量：乔善义等人采用HPLc法检查所得多糖的纯度和测定分子量，由标准Dextran(分子量分别为52700，43000，21400，17500，5000)的分子量对数与保留时间求得标准曲线，求m回归方程，再根据保留时间求出样品的分子量。13课题立项依据和研究内容范俊安等人进行过山药多糖提取工艺的优化研究m1，但是分析简单，统计分析不完善，可信度不高，因而有必要对提取工艺重新进行优化并进。步放大，以适应工，规模化生产的需要。赵国华等人从山药中分离卅了中性多糖|2“，但没有分离卅过酸性多糖，对山药酸性多糖组成、结构、分子量分析至今没有相关文献
9、报道。本研究将采用单因素设计、正交试验和中心组合试验，结合数理统计方法进行工艺优化，并采用多元线性回归分析建立数学模型，最终获得最佳多糖提取工艺，为工业化放大提供基础。同时进行山药酸性多糖和中性多糖分离纯化，在此基础上测定多糖的分子量、组分和摩尔比，并用现代仪器分析表征多糖的部分结构。浙江人学硕十学位论文第二章材料与方法21仪器和设备Bs160A自动部分收集器 卜海沪西分析仪器厂TH一型梯度混合器 卜海精科实业有限公司BTi00100M型恒流泵 保定兰格叵流泵有限公司分光光度计HP一6010 美国惠普公司离心机20PR一52D 日本日立公司真空泵sHB1ll 郑州长城科工贸有限公司旋转蒸发器R
10、系列 卜海申生科技有限公司纯水蒸馏器D18lDC 卜海申胜生物技术有限公司磁力搅拌器78一lA 杭州仪表厂微量分析天平 li海精密科学仪器有限公司玻璃板，毛细管，层析缸，吹风机 校设备科电热干燥箱 DHG一9140A l海一恒科技有限公司pH计 德国checkerNexus 670 FT一取傅立叶变换红外光谱分析仪 美国Mcolet公司HP6890气相色谱仪 美国hcers高效液相色谱仪 waters公司22主要材料和试剂DEAE一52填料 国药集团化学试剂有限公司Dextran T一系列 北京经科公司Sephadex G100 卜海化学试剂厂蓝色葡聚糖 国药集团化学试剂有限公司透析袋(截留M
11、lJ4，Ooo) ，l海生工毗啶 卜海凌峰化学试剂有限公司盐酸羟胺 浙江杭州双林化工试剂厂乙酸酐 卜海凌峰化学试剂有限公司95(食用级)乙醇 杭州常青化工有限公司16浙江人学硕十学位论文第二章材料与方法21仪器和设囊薹￥一；?!蚕誊钳”骓配野掣 琶h兰“篱戥潍明瞪器董一唆罄增匾目每 西盛浓m雩喁膨哨叫1妻薹l螂i醣酆瑞醛 晡西葑誉鞋裂r拳亨箬薹翼葡羹嚣囊童囊琵羔 格些婴豆忑瞪刁馕蓬目i篓塑一l墓 冀尊冀毳霎荔潇H譬雩耋莲： 毫卜”托糖硼篓蓄戡驵酆鲤雅瑟是复是争 萋gfi鬟静飘鳓巍莺嘉霪囊叁鋈墓蓥hub和几个与之不可分离的USB功能 设备。图28是复合设备的逻辑结构图。234数据流模 型简介有了
12、上一节对us B主机和设备的认识，这一节我们介绍UsB系统的数据流。在这里我们不关注 信号具体的物理形式和传输方式等细节，相关的内容将在后面几节介绍。简单的 说，数据流发生在主机和USB设备之间，我们以常用的分层模型介绍US B系统的数据流。如下图29所示：”5” 客户较仲世=： 剖应：聃能瞿MCDl弧B拳婉转件LfIuS8生控制嚣 lI I II I临B泌I聃l浙江人学i!i l学位论文98浓硫酸 ，卜海试剂总厂氯仿 杭州高晶精细化工有限公司D一果糖 卜海伯奥生物科技有限公司蔗糖 中国医药(集团)卜海化学试剂公司D一葡萄糖 汕头市光华化学厂D一木糖 中国医药(集团)卜海化学试剂公司鼠李糖 中
13、国医药(集团)_海化学试剂公司D一半乳耱 二海恒信化学试剂有限公司D一甘露糖 北京化学试剂公司(比利时进口分装)阿拉伯糖 中国医药(集团)卜海化学试剂公司23实验方案和技术路线231多糖提取工艺步骤pH值，温度、时间山药洗净去皮，匀浆 -加适量的水制成山药溶液+蒸发浓缩+乙醇沉淀多糖+离心分离多糖 -冷冻干燥得粗多糖232分离纯化步骤称取2009洗净去皮的新鲜山药，匀浆，在料水比l：5，浸提温度85，调节pH值到8O条件下浸提111r后，1900g离心10111in取卜-清，加入30中性蛋白酶42作用211r，离心取卜清浓缩到200m1，1900g离心20血n后取卜清加入酒精浓度到70，190
14、0g离心lOIIlin取沉淀溶于水后再透析23d，将透析后糖液浓缩到10ml。将此样液首先卜-DEAE一52层析柱，分离m中性多糖和酸陛多糖后再卜-sephadexG一100柱层析，由此可得到纯净的山药多糖。233多糖含量测定测糖的方法主要采用苯酚硫酸法。标准曲线的绘制：称取烘干至恒重的无水葡萄糖199，溶于1000叫重蒸水中，配成19L的标准溶液。然后将标准溶液稀释成浓度(取lIrd稀释100倍，浙江大学钡士学位论文2ml稀释loo倍，3rnl稀释100倍)为19，38，57，76，95，114，133，152“gml的溶液，用移液器各取溶液06IIll溶液置于101111干燥的试管中，加入
15、509，L的苯酚溶液12m1，用漩涡混合器混匀后，迅速加入6 Ornl浓硫酸，漩涡振荡混匀后室温放置30111in，在波长490nm测定吸光度，用蒸馏水代替葡萄糖溶液做空白对照。以吸光度为纵坐标，糖浓度为横坐标得标准曲线。根据葡萄糖标准曲线可以测定寡糖或多糖的含量。取样液O6m1，加入12m1苯酚溶液，摇匀再加入6m1浓硫酸剧烈振荡，放置30rnin后测其吸光度，在根据吸光度从曲线卜读出相应的糖含量。标准曲线见图21。100 120 1，iO鞯沐I皇(p g加1)图2一l苯酚硫酸法测糖含量标准曲线标准曲线方程为：A490一O0062c+O，0215 R2=O99测糖含量时将所测到的吸光度代入标
16、准曲线即可求出所测溶液的糖含量。234蛋白质含量的测定由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，在280nm有最大吸收峰。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(A280)与其浓度成正比关系，可用作定量测定。但是不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在。一定的误差。但可以作为初步定量的依据。试剂!：；-lnv；O0型采冬一浙江人学顺f学位论文标准蛋白溶液：准确称取标准蛋白质，配制成浓度为1m咖L的溶液。待测蛋白溶液：配制成浓度约为lmmL的溶液。操作方法标准曲线的绘制：安下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。用石英比色杯在280
