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1、核酸抽取及杂交,上海交通大学医学院 李莉 讲师,第一部分 DNA提取总论,一、提取DNA总的原则：,1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。,二、样本来源：,理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取DNA 样本选择取决于试验目的 全血是基因组提取最常见的样本,血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的60%以上,
2、DNA提取前样本采集、预处理和保存：,（一）全血1.抗凝剂EDTA-Na2或枸橼酸钠作为抗凝剂不宜使用肝素,mRNA逆转录后RT-PCR结果（0、3、6个月）,A B C D,（二）血浆和血清,血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测中,血浆DNA又称为循环DNA，是一种无细胞状态的胞外DNA，主要是游离的单链、双链DNA或DNA-蛋白质的混合物 它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景 血浆DNA成分的来源分为内源性和外源性两个部分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入
3、血液的核酸是外源性血浆DNA最重要的成分,血浆DNA,内源性循环DNA,外源性循环DNA,自身基因组来源DNA,入侵的病毒、细菌等病原体,死亡细胞,活细胞释放,（三）体液,尿液、胸水、腹水和脑脊液等标本离心后取沉淀提取体液中细胞的核酸 对释放入体液中的病毒或细菌的游离核酸，采用超高速离心或体液浓缩后再提取核酸,（四）分泌物,（以痰液为例） 痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要样本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前应先漱口，以避免混入大量的口腔脱落的上皮细胞和唾液等影响检测结果,结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆菌的核酸，使用生理盐水后取上清液 痰
4、液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率,三、DNA的收率,四、DNA提取的基本步骤,1、核酸的释放：破裂细胞 释放核酸机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应最广泛的方法）,各种组织细胞破碎方法,破裂细胞 、释放核酸,2、核酸的分离与纯化：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 他物质分离非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液,3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤,4、DNA鉴定,DNA的鉴定浓
5、度鉴定纯度鉴定完整性鉴定,浓度鉴定,1）紫外分光光度法：测定DNA在A260nm的光吸收值。如计算DNA浓度A260稀释倍数50 g/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。,(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸）,各种碱基的紫外吸收光谱,2）荧光光度法荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）,EB与DNA的结合,500l全血提取的基因组DNA电泳,动物组织提取基因组DNA,纯度鉴定,紫外分光光度法：在260nm和280
6、nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。A260与A280之比应在1.80；纯的RNA A260与A280之比应在2.0。 A260/A280比值是纯度检测的重要指标。,完整性鉴定,凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。,5、核酸的贮存DNA保存,1）短期贮存：4或-20存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于
7、7.0时DNA容易变性。 2）长期贮存：TE缓冲液中-70保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。,第二部分 基因组DNA的分离与纯化,一、DNA样品准备,常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70或液氮,二、DNA提取,（一）酚抽提法：先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100150kb。,DNA酚抽提法示意图,主要试剂的作用：EDTA：1 二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2 降低细胞膜的稳定性,SDS的作用：
8、1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来 3 对RNA、DNA酶有抑制作用 4 与蛋白质形成R-O-SO3 .R蛋白质复合物，使蛋白质变性,蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用,苯酚的特点： 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水 提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率 氧化苯酚会破坏DNA,为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？,苯酚在空气中经常被氧化生成醌
9、，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。,PH8.0的Tris溶液可以似的抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。 在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。,DNA的沉淀,1）无水乙醇沉淀沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。 2）异丙醇沉淀除了使DNA沉淀
10、外，还可以溶解少量的小的RNA分子,（二） 甲酰胺解聚法： 破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤 甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA 200kb左右。,（三） 玻璃棒缠绕法： 用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb,DNA玻棒缠绕法示意图,（四） 表面活性剂快速制备法：用Triton X-100或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。,
11、二、DNA的浓缩,1、固体聚乙二醇（PEG）浓缩：用透析袋 外敷PEG至合适量 2、丁醇抽提浓缩：DNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNA不会。因此重复几次可显著减少DNA体积,三、DNA回收,主要是从电泳中分离回收DNA片段 回收原则：尽量提高回收率去除回收DNA样品中的污染物,（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段,（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段,1.二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法 2.电泳洗脱法 3.冷冻挤压法 4.低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法,（一） 从琼脂糖凝胶中回收DNA片段,电泳到DEAE-纤维素膜 ：DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的DNA分子在
12、所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳至条带DNA都到膜上，取出洗下500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。但不适用于分子量超过10kb和单链DNA,透析袋电洗脱 ：切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，DNA出胶后进行抽提DNA回收。,低熔点琼脂糖凝胶：切下胶，加热到65熔化胶，然后抽提回收DNA。方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。,琼脂水解酶：将含DNA的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用酚抽提方法回收DNA,（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段,聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。虽费时但操作简单，是小片段D
13、NA回收的较好方法。,至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。,DNA提取试验中常遇到的问题,基因组DNA收率较低或无基因组DNA样本材料太少细胞破裂不够充分，DNA释放不完全离心力偏小两相分离不完全 ,DNA降解的原因样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本本身存在大量DNA酶 提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因组DNA盐浓度过高基因组DNA中乙醇未清除净基因组DNA中可能存在其他抑制因素 提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因加入多糖，保护DNA长度,质 粒 DNA 制 备 plasmid extraction,质粒
14、简介,质粒(plasmid)是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子 其大小范围从lkb至200kb以上不等。已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复 制和遗传的辅助性遗传单位。,Chromosome DNA genome,Plasmid DNA,质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术,质粒特性,1. 分子相对小 2. 含有高效的自主复制成分 3. 不相容性(incompatibility) 4. 转移性 5. 选择的标记(selective
15、 markers) 6. 限制性内切酶单一切口,质粒的结构特点,分子量相对较小共价闭合分子双链环状结构,具有更强的抗切割和抗变性能力,超螺旋DNA分子 线性DNA分子 半开环DNA分子,Plasmid vectors,表达载体,载体含有tac启动子、Lac操纵基因、SD序列、Lac I阻遏蛋白基因等,Exprssion vector,细菌收集,纯化质粒DNA,细菌培养,细菌裂解,质粒DNA的提取和纯化,质粒DNA的提取和纯化,一、细菌的培养 (bacterial culture) l 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒DNA也在自主复制。,对于松弛型质粒
16、，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素（chloromycetin）抑制宿主蛋白质的合成和染色体DNA的复制。质粒DNA的复制不受影响而大量扩增,l 所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量 有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。,二、细菌的收集(bacterial collection),细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒DNA的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用STE或生理盐水悬浮，漂洗l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净。,三、细菌裂解,细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。,质粒提取的方法,
