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1、,第八章原生质培养和体细胞杂交,主要内容,植物原生质培养的目的和意义 原生质分离 体细胞杂交 原生质体培养,一、植物原生质培养的目的和意义,1、原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。 核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质
2、,据统计，目前已有49个科，160个属的360多种植物经原生质体培养得到了再生植株。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。,二、原生质体分离,1、植物原生质体的分离方法,（1）原生质体的机械制备 （2）原生质体的酶法分离,（2）Enzymatical preparation of protoplasts,Basic technique:,二、影响原生质体产量和活力的因子,1、材料的来源 2、前处理 3、酶处理 4、渗透压,1、材料的来源,无菌试管苗叶片、上胚轴和子叶 温室或生长室栽种的植物 培养细胞,温室或生长室栽种的植物,一般生长在下述条件下
3、的植株能产生较好的效果:低光照强度1000lx,短日照,温度范围20-25度,相对湿度60%-80%,以及充足的氮肥供应. 禾本科和其他一些物种的叶肉细胞难以分离原生质体,因此在这些植物中一直利用培养细胞作为供体材料.,2.前处理,A、材料用黑暗处理、低温处理和不同光质照射、材料的预培养等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同。 龙胆试管苗只有用低温处理原生质体才能分裂； 甘蔗植株只有现在黑暗条件下培养12小时后分离的原生质体才能分裂； 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48小时后分离原生质体，才会获得较高的原生质体产量。,B、消毒 C、保证酶解充分进行，促使酶
4、溶液渗入到叶片的细胞间隙中。 方法： 1.撕去叶片的下表皮，然后以无表皮的一面向下，使叶片漂浮在酶溶液中； 2.把叶片或组织切成小块，投入到酶溶液中，可与真空渗入相结合。,3、酶处理,分离植物细胞原生质体所必须的两种酶是纤维素酶和果胶酶，后者的作用主要是细胞间的果胶质降解，前者是消化细胞壁纤维素。 对于某些组织来说,除了纤维素酶和果胶酶外可能还需要半纤维素酶.比如:大麦的糊粉细胞以纤维素酶处理以后并不能把原生质体释放出来,这是因为在原生质体周围还留下一层抗纤维素酶的壁,这类细胞称做原生质球,只有用半纤维素酶处理才能把它们剩余的壁除掉.,A、纤维素酶 目前市场上主要有日本生产的分解细胞壁较好的纤
5、维素酶：Onozuka、Meicelase、Driselase。纤维素酶Onozuka根据活力高低又分为P1500、P500和R-10等数种。主要含有纤维素酶C1（作用于天然的和结晶的纤维素）、纤维素酶Cx，纤维素二糖酶，木聚糖酶、葡聚糖酶果胶酶、脂肪酶、核酸酶、溶菌酶等。,B、半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。常用的是Rhozyme Hp150 C、果胶酶是从根霉中提取的，使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。常用的果胶酶有MacerozymeR-10（离析酶，主要成分是果胶酶），此酶的活性较高，但含杂酶也较多，如使用浓度过高，时间过长，则有毒害作用。Pectalya
6、seY-23（离析软化酶），此酶活性极高，一般叶片使用量为0.1%，悬浮细胞0.05%,原生质体分离常用的商品酶 酶 来 源 生产厂家 纤维素酶类 onozuka R10 绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 绿色木霉 Calbiochem., San Diego, CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo, Japan 果胶酶类 Macerozyme R-10 根霉 Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, Japa
7、n Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USA Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 半纤维素酶 Rhozyme HP-150 黑曲酶 Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USA Hemicellulase 黑曲霉 Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA,酶解时间,酶浓度,酶解温度,酶处理效果,酶浓度,植物材料须按比例和酶液混合才能有效地游离原生质体，
8、一般去表皮的叶片需酶量较少，而悬浮细胞则用酶量较大。,酶解时间酶解温度,酶解处理一般地在黑暗中静止进行，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。对于悬浮细胞，愈伤组织等难游离原生质体的材料，可置于摇床上，低速振荡以促进酶解。酶解时间几小时至几十小时不等、以原生质体游离下来为准。但是，时间过长对原生质体有害，所以一般不应超过24h。酶解温度要从原生质体和酶的活性两方面考虑。对于这几种酶来说，最佳处理温度在4050但这个温度对植物细胞来说太高，所以一般都在25左右进行酶解。,酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。用菜豆叶片作培养材料时，发现原始pH值为50时， 原生质体产生得很快，但损坏较严重，并
9、且培养后大量破裂。当pH值提高到60时，最初原生质体却产生少，但与pH值为50时处理同样时间后相比，原生质体数量显著增加。 高活性低 低原生质体损坏多 纤维素酶，p H5.4，果胶酶5.8，两种混合5.45.6,酶液pH值：4.7-5.8，,4.渗透剂,植物细胞壁对细胞有良好的保护作用。去除细胞壁之后如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体有可能涨破或收缩。因此在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同，或者比细胞内渗透压略大些。渗透压大些有利于原生质体的稳定，但也有可能阻碍原生质体的分裂。 因此，在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳
10、定，避免破裂。,常用的两种系统为,糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.400.80mmolL。本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂； 盐溶液系统：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。,另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。,5、细胞质膜稳定剂 细胞质膜稳定剂，能防止质膜破坏，提高原生质体的稳定性与活性，促进细胞壁形成及细
11、胞分裂等。 常用质膜稳定剂有：葡萄糖硫酸钾、MES、CaCl2H2O、KH2PO4等。 MES:2-( N-morpholino) ethanesulfonic acid， 2-( N-吗啉)乙烷磺酸 作用：不但具有质膜稳定作用，还具有缓冲作用，调节pH值。,酶解处理时把灭菌的叶片或子叶等材料下表皮撕掉，将去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在无菌条件下将叶面晾干、顺叶脉轻轻撕下表皮。如果去表皮很困难，也可直接将材料切成小细条，放入酶液中。对于悬浮细胞等材料，如果细胞团的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龙网筛过滤一次，将原细胞团去掉，留下较均匀的小细胞团时再进行酶解。,6、原生质体分离
12、（以叶片为例）,A、两步法分离植物原生质体 先用果胶酶离析植物组织，使植物细胞从组织中分离出来，然后收集细胞洗涤后用纤维素 酶解离细胞壁获得原生质体 B、一步法分离 把一定量的纤维素酶和果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。,三、Purification of the isolated protoplasts,酶解后的混合物包括：解离酶液中，有原生质体，有破碎细胞的细胞器等，也有未解离的组织或细胞。而培养只要干净的原生质体。所以要进行纯化。 净化的方法： A、清除较大碎屑：酶解后的混合物穿过一个镍丝网（50-70um）,B、清除较小的物质：,1.沉降法 2.漂浮法 3.界面法,1.沉降法,
13、镍丝网滤出液 置于离心管（离心2-3分钟，原生质体沉于离心管底部，残液碎屑悬浮于上清液） 弃去上清液 再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中（反复3次） 常用的清洗培养基CPW盐溶液成分（mg/l）,转速的控制以将原生质体沉淀而细胞碎片等杂质仍悬浮在上清液中为准，一般于500800r/m的转速下离心35min。用吸管小心的吸掉上清液，用洗涤液洗涤三次，然后用培养基将原生质体调整到一定密度后进行培养。,2.漂浮法,根据原生质体来源不同，利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。,3.界面法,原生质体纯化,以柑桔为例,Purified protoplasts,四、原
14、生质体活力测定,目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。 如形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。,FDA法： 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。,影响原生质体活力的因素,分离材料的生理状态 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响,第三节 原生质体的培养,供体植物的选择,原生质体的培养基,培养条件,培养方法,细胞分裂与愈伤组织形成,细胞壁的形成,植株的再生,影响原生
15、质体培养的因素,一、原生质体的培养基,1在多数情况下原生质体所用的基本培养基为NT，KM，DPD、MS、B5 2无机盐 大量元素浓度；（一般要低于愈伤组织培养基） NO3和NH4+的比例；（降低NH4+ 、NO3 增加有机氮） Ca2+浓度（增加，适当的浓度，能提高分裂细胞的百分数） 3有机成分 维生素、氨基酸、糖（常用葡萄糖，过滤灭菌）及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白 4激素 常用的激素：NAA、IAA、2,4-D（先高后低）与 BA 5pH值,二、培养条件,最初4-7天分离出来的原生质体应在黑暗中培养（对光很敏感，少做观察）； 当细胞壁完整形成后，细胞具有耐光的特性，这时转入光下培养。 温度一般为27-29 度,三、原生质体培养方法,1.液体浅层培养,将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。一般直径3cm加1-1.5ml培养液，6cm加2-3ml 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：是原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步生长与发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。,
