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1、2018年9月13日星期四,1,医学 分子生物学 实验技术,2018年9月13日星期四,2,第一章 蛋白质的分离纯化,生命大分子物质的特点： 1、生命大分子是动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所产生的活性物质 2、生命大分子的特殊性和复杂性 3、生命大分子都是由简单的小分子构成的物 4、具有特殊的结构和功能 5、生命大分子不稳定,2018年9月13日星期四,3,材料的选择与处理,材料的选择,有效成分：欲纯化的某种单一的生命大分子物质。相对于有效成分以外的物质称杂质。,材料来源,动物,植物 根、茎、叶,微生物,组织、器官,血液、分泌物,2018年9月13日星期四,4,选材原则：,含有效成分丰富、
2、稳定性好；,来源丰富、保持新鲜；,材料适合加工提取；,具有经济利用价值。,组织差异性,时间差异性,生理状态差异性,研究对象的选择,2018年9月13日星期四,5,蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。蛋白质的分离(separation，isolation)和纯化(purification)工作是生物化学中一项艰巨而繁重的任务。,2018年9月13日星期四,6,蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度(purity)或比活(specific activity)，以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性(比活常以活力单位数毫克蛋白质表示)。 分
3、离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级分离和细分级分离3步,2018年9月13日星期四,7,(1) 前处理 (pretreatment),分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。 动物材料应先剔除结缔组织和脂肪组织。,2018年9月13日星期四,8,种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。 然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。,2018年9月13日星期四,9,机械破碎法,捣碎法,研磨法,匀浆法,物理破碎法,温度差破碎法,压力差破碎法,超声
4、破碎法,化学破碎法 利用化学渗透的方法，通过有机溶剂、抗生素、表面活性剂、金属熬合剂、变性剂等，使细胞膜破碎的方法。,酶促破碎法 利用酶的活性破坏细胞膜的化学结构使细胞膜破碎的方法。,2018年9月13日星期四,10,如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用差速离心方法将它们分开,在不同离心力场下沉降的细胞器,2018年9月13日星期四,11,如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚，然后用适当的介质提取。,2018年9月13日星期四,12,(2) 粗分级分离 (rough fractionatio
5、n),当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白分离开来。 一般这一步的分级分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质(包括脱盐)，又能浓缩蛋白质溶液。 有些蛋白质提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓缩。,2018年9月13日星期四,13,(3) 细分级分离 (fine fractionation),进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤，离子交换层析，吸附层析以及亲和层析等。必要时还可选择电泳法，包括区带
6、电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小，但分辨率很高。,2018年9月13日星期四,14,(4) 结晶,结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，蛋白质纯度愈高，溶液愈浓就愈容易结晶。尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。 由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 结晶也是进行X射线晶体学分析所要求的，结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。接入晶种常能加速结晶过程。,2018年9月13日星期四,15,第二节 确立测定方法,寻找哪些生物
7、材料中含有有效成分,监测有效成分提纯程度,光谱法,吸收光谱,荧光光谱,浊度分析,电化学法,生物活性检测法,免疫分析法,2018年9月13日星期四,16,吸收光谱,根据有效成分的颜色、对紫外吸收能力进行测定；,利用有效成分与生色基团所进行的特殊的呈色反应进行测定。,荧光法：利用有效成分所进行的特殊的化学反应并偶联NAD或NADP的还原反应产生NADH或NADPH。还原型尼克酰胺发荧光。也可利用NAD和NADP的光谱变化进行测定,2018年9月13日星期四,17,2018年9月13日星期四,18,比色法,葡萄糖O2 H2O 葡萄糖酸H2O2,葡萄糖氧化酶,H2O2酚4AAP 醌亚胺H2O,浊度法：
8、测定悬浮液在不被吸收的波长下表观的消光值。,电化学法：测定反应过程中H的浓度变化从而计算出有效成分含量。,生物活性检测,免疫分析法,2018年9月13日星期四,19,纯化方案的设计与评价,纯化方案：在纯化某一物质过程中，根据被分离物质的理化性质、分离方法的优劣，将几种分离方法有机地结合并灵活应用，实现提取被分离物质的技术路线，称纯化方案。,2018年9月13日星期四,20,初分离,精细分离,盐析法,有机溶剂沉淀法,电泳法,层析法,离心法,离子交换层析,排阻层析,亲和层析,纯化方案的设计与评价,2018年9月13日星期四,21,纯化方案的设计与评价,纯化方案的评价：是对组成纯化方案的每一种分离方
9、法的评价。,有效成分的含量测定,比活力测定( ),活力单位数,毫克蛋白,纯化倍数( ),每步的比活力,粗提液比活力,收得率( 100 ),每步的总活力,粗提液总活力,评价指标,2018年9月13日星期四,22,蛋白质纯度和性质的分析,纯度分析,性质分析,比活性,电泳分析,高压液相或气相色谱,免疫分析,分子质量测定,分子结构测定,2018年9月13日星期四,23,几种常用的蛋白质纯化方法：,根据蛋白质在溶液中的性质分离纯化蛋白质的方法：分子大小； 溶解度； 电荷； 吸附性质； 对配体分子的生物学亲和力等。,2018年9月13日星期四,24,根据分子大小不同的纯化方法,1透析和超过滤 透析(dia
10、lysis)是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。常用的半透膜是玻璃纸和其他改型的纤维素材料。,2018年9月13日星期四,25,超滤是利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。,2018年9月13日星期四,26,2密度梯度(区带)离心,蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成独立的区带，,2018年9月13日星期四,27,密度梯度,常用的密度梯
11、度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度。 蔗糖便宜，纯度高，浓溶液(60，WW)密度可达1.28 gcm3。 聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1氯2，3环氧丙烷合成的高聚物，Mr约400 000。 密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大，向上逐渐减小,2018年9月13日星期四,28,凝胶过滤层析 (分子排阻 ),（1）凝胶过滤的介质 凝胶过滤所用的介质是凝胶颗粒，其内部是多孔的网状结构，,2018年9月13日星期四,29,二、利用溶解度差别的纯化方法,影响蛋白质溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH，离子强度，介电常数，温度。 自身因素：在同一的外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度，这
12、是因为溶解度归根结底取决于它们本身的分子结构，例如分子所带电荷的性质和数量、亲水基团与疏水基团的比例，它们在蛋白质分子表面的排列以及由此而产生的偶极矩等。,2018年9月13日星期四,30,1. pH控制蛋白质的沉淀,蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。,2018年9月13日星期四,31,2. 蛋白质的盐溶和盐析,盐溶：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。,由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水
13、分子间的相互作用却加强，因而溶解度增高,盐溶,2018年9月13日星期四,32,盐析：当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来，这种现象称为盐析（salting out）。,2018年9月13日星期四,33,3有机溶剂分级分离法,与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇和丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。,2018年9月13日星期四,34,3有机溶剂分级分离的机理,有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因之一是改变了介质的介电常数。水是高介电常数
14、物质(20时，80)，有机溶剂是低介电常数物质(20时，甲醇33，乙醇24，丙酮21.4)，因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低。这样，蛋白质分子表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。 有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似，与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。,2018年9月13日星期四,35,4温度对蛋白质溶解度的影响,在一定温度范围内，约040之间，大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加， 在4050以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解能力。 大多数蛋白质在低温下比较稳定，因此蛋白质的
15、分级分离操作一般都在0或更低的温度下进行。,2018年9月13日星期四,36,电泳 是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象,蛋白质的电泳分离,2018年9月13日星期四,37,蛋白质胶体颗粒的沉淀,带正电荷的蛋白质,带负电荷的蛋白质,在等电点的蛋白质,酸,酸,碱,碱,脱水,脱水,脱水,不稳定的蛋白质颗粒（沉淀）,带正电荷的蛋白质（疏水胶体）,带负电荷的蛋白质（疏水胶体）,碱,酸,（亲水胶体）,（亲水胶体）,（亲水胶体）,2018年9月13日星期四,38,带电颗粒在电场中所受到的电场力,F=EQ,根据Stoke定律，球形分子在液体中泳动所受到的阻力,F=6rv,电泳原理：,20
16、18年9月13日星期四,39,F=F,即：EQ= 6rv 时，,当物质在电场中移动时，受到电场力和液体阻力两方面的力的影响，当电场力和阻力平衡时，带电颗粒作匀速运动，,2018年9月13日星期四,40,两个带电颗粒能否分开，由两个颗粒在电泳过程中的迁移率所决定，即,或,2018年9月13日星期四,41,迁移率（或泳动度）是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度，可用下列公式计算： =/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt 为迁移率（cm2V-1min-1）；为颗粒泳动速度（cms-1）；E为电场强度（Vcm-1）；d为颗粒泳动的距离（cm）；l为滤纸有效长度（cm）；V为实际电压（V）；t为通电时间（s或min）。通过测量d, l, V, t, 即可计算出被分离物质的迁移率。,
