生命的光

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1、1巨噬細胞對光線療法的反應程度巨噬細胞對光線療法的反應程度SteveSteve Young,Young, PhD,PhD, PeterPeter Boiton,Boiton, BSc,BSc, MaryMary Dyson,Dyson, PhD,PhD, WillWill Harvey,Harvey, PhD,PhD, 倫敦 Eastman 牙醫學院口腔外科 WC1(W.H.) 及倫敦 Omega 研究實驗室 N16UT(C.D.)巨噬細胞是修補傷口的重要介質之一。本研究的目的在了解光線能否剌激或釋 出這類的介質。 本研究運用一已知的巨噬菌狀細胞列(U-937) 。此細胞在培養中曝晒於下列波長

2、 光線下：660nm、820nm、870nm 和 880nm。820nm 光源為同調且偏振，其他波 長光源則為非同調。經過 12 小時曝晒後，移除巨噬菌上澄液表層並置於 3T3 纖 維組織母細胞培養菌上。經過 5 天的時期後，再對纖維組織母細胞的增殖加以 評估。結果顯示 660nm、820nm 和 870nm 波長會促進巨噬菌釋出因子剌激纖維組 織母細胞增殖高於控制水準，而 880nm 波長會抑制這些因子的釋出或促進某些 纖維組織母細胞增殖的抑制因子。這些結果顯示某些特定波長的光，藉著提供剌激或抑制纖維組織母細胞增殖的 必要因子，可能成為有用的治療劑。對某些波長同調性並不重要。關鍵字：纖維組織

3、母細胞、雷射生化調制、傷口修補。簡介簡介巨噬細胞可以禁止或增加細胞許多活動的類型。如果不同波長的光可以影 響巨噬細胞在試管中的活動，釋放出引起相對效果的因素，那麼光線療法也可 在調節傷口修復上具有巨大潛力。例如：傷口可能容易腫大或形成疤腫，也許 可以藉由波長刺激釋放治療抑制因子，像是前列腺素，抑制纖維組織母細胞活 動，而在靜脈曲張的病例，問題是出在修補的遲緩，可施予波長能加強釋放剌 激因子像是單核球激素，可以激勵纖維組織母細胞的活動和發展組織形成結疤。這項研究的目的，藉著各種不同波長的同調和不同調光線來照射巨噬細胞 的培養物，以了解巨噬細胞是否可以激勵釋放或合成修復傷口的因子。雖然巨 噬細胞不

4、能像 U-937 細胞線一樣的培養，但是這些細胞已顯示刺激細胞有絲分 裂的活動以培養細胞增殖。這個細胞線倍增時間(20 到 48 小時) 很迅速，所以 可以快速獲得大量的數量，它們提供同質性的細胞族群，此外，龐大容量的條 件化培養液可快速且便宜的獲得。2U-937 細胞存在於靜止而柔軟的成熟狀態，它們的顯型類似單一膨脹體， 然而，組織化學上它們顯示單核白血球的特性。U937 細胞可利用像 TPA(四荳 蔻的佛波醇醋酸鹽)和 DMSO(乙烷硫磺)的化學物引起催熟，這些細胞成熟的特 性通常是量的改變而不是質的改變5。在 U937 細胞的細胞化學的發現，顯示它們是巨噬細胞的良好模型，其中 一個最重要

5、的標誌是細胞合成和分泌溶菌酵素的能力，這是單核白血球和巨噬 細胞的特質7，雖然溶菌酵素是由其他類型細胞如嗜中性白血球的合成，製造 的釋放只能由細胞的分裂，而不是分泌過程來達成(8)，淋巴細胞不製造溶菌酵 素(9)，溶菌酵素的合成和分泌因此似乎是單核白血球巨噬細胞的可靠細胞特性。在 U937 細胞之細胞化學發現，也顯示它們和巨噬細胞的密切關聯，酯污 染是強烈的陽性反應，特別是奈酚 AS-D 醋酸纖維的酯反應為陽性並受 NaF 的 顯著抑制，這種反應只有在單核白血球中有見到。(10)外觀標註研究已顯示 C3 和 Fc 兩種受體， （用 rosette 技術 EA7S 查出）(11)， 這個活動模式

6、曾發現於正常的巨噬細胞中。(12-14)因為 U-937 顯示許多人體巨噬細胞的特性，使用細胞線為模型，以更加了 解巨噬細胞對傷害和後續光線效果反應的機制被認為是適當。材料和方法材料和方法細胞培養U-937 細胞細胞 - U-937 是在 RPMI 1640(流體實驗室)中培養，培養液是 1%的 盤尼西林和鏈黴素(Gibco)及 10%受熱不會活化的牛胚胎血漿(Gibco)，大約每兩 天會再次培養，細胞在 50ml Nunc 燒瓶中成長，每一個燒瓶包含 9ml 的細胞培 養液，細胞在 37和含 5%CO2大氣的培育器中成長，每一個會合的燒瓶包含 約 9X106的細胞。纖維組織母細胞纖維組織母細

7、胞纖維組織母細胞從瑞士 3T3k 老鼠的腎臟分離(由皇室癌症研究中心提供)， 它們再杜貝可最低基本培養液中成長(DMEM)，供給 10%牛胚胎血漿(FCS)和 1%的 鏈球菌，培育器維持在 37和 5% CO2的大氣，再次培養後再三天會合培養， 當會合每個燒瓶，包含大約 3-4X106的細胞，過量的培養液倒出來，細胞由磷 酸鹽緩衝鹽沖洗(PBS)，增加五毫升的胰蛋白到每個燒瓶中，分層覆蓋約 30 秒，過量的胰蛋白倒出，將燒瓶倒著放回培育器，讓細胞覆蓋表面留在最高3位置，讓任何在燒瓶中的胰蛋白不會和它們接觸到，這可以防止任何殘留在 燒瓶中的胰蛋白過量的傷害，10 分鐘後細胞分離，加入三毫升的 D

8、MEM 到每 個燒瓶中，將產生的細胞懸浮倒進一般的容器中。細胞用滴管吸至 50l 的容量 微玻璃片，讓每個微玻璃片皿包含 1000 個細胞，細胞懸浮的培養液是 50:50 的 DMEM 和從不同的 U-937 及 RPMI 處理組所取得的浮於表層物（見下列） ；這 是次佳的培養液，所以刺激是可能的。U-937 照射照射當融合後，細胞的轉移到消毒過的 1ml 容量 24 皿培養皿 (流體實驗室)， 細胞密度是 1ml 一百萬個，稀釋液則是新鮮的 RPMI。圖 1：曝光的 U-937 細胞懸置於光線療法的實驗排列然後使用生物療法 3ML 裝置(Omega 全球技術)，讓每個皿暴露在假的照射下 20

9、 秒，或光線照射下 20 秒(見圖一)，四個不同的波長：660 nm、820 nm、870nm、和 880nm，光來源的物理參數詳列如下：非同調來源(Omega 超亮二極體)： 1. 波長：660 nm、870 nm、880 nm。 2. 主動媒介：砷鋁化鎵(GaAlAs) 3. 平均能量產出：15mW 4. 在 1 cm 距離的點大小：0.125 c 5. 能量密度：120mW/c 6. 100%密度(15mW) 之光譜源頻寬：5 nm 7. 總分散角度：10 8. 脈衝頻率：5000 Hz49. 脈衝寬度：18 sec同調光源(Omega 雷射二極體)： 1. 波長：820 nm 2. 主

10、動媒介：砷鋁化鎵 GaAlAs 3. 平均能量產出：15mW 4. 在 1 cm 距離的點大小：0.125 c 5. 能量密度：120mW/c 6. 100%密度(15mW) 之光譜源頻寬：0.01 nm 7. 總分散角度：23平行接合平面，16垂直接合平面 8. 脈衝頻率：5000Hz 9. 脈衝寬度：18sec用量測定： 1. 暴露時間：20 秒 2. 能源密度 2.4J/ c光源用 Photodyne 水平反應能量計(PX16E)校準。 在照射之後，細胞放置 30 分鐘，然後用每分鐘 500 轉離心 5 分鐘，懸浮在 新鮮的 RPMI 中，放置在培育器中 12 小時。細胞就會再以每分鐘

11、500 轉離 心五分鐘後，隨即收集浮在表層物和保存在零下 20。RPMI 照射照射為了能決定究竟光的增殖反應是因為細胞透過培養液，還是因為照射對細胞的直接效果，只以 RPMI 像 U-937 細胞一樣的被照射，U-937 細胞也在 PBS 中受照射，然後轉移到新鮮的 RPMI 中，留在培育器中過夜，照射的培養液收 集後保存在-20。巨噬細胞可存活性分析巨噬細胞可存活性分析懸浮在培養液中的巨噬細胞樣本，經照射過或假照射過，都被徹底混合後， 再將 0.5 ml 的懸浮移到玻璃瓶中，一滴的 Trypan blue（0.5% w/v）染料被加進 懸浮物。一滴懸浮物再被轉移到 Neubauer 計量室中

12、。在這存活性測試中15， 所有死亡的細胞被染成藍色，可存活的細胞能排除染料，保持無色。可存活的 細胞數目以總數的百分比來計算。纖維組織母細胞增殖分析纖維組織母細胞增殖分析所有的浮在表層物接著使用 Marin 等人16的亞甲基藍分析，分析在纖維 組織母細胞中的增殖，每個 96 皿的小玻片設定如下：1) 50l 的 DMEM(包含5大約 1000 纖維組織母細胞)放置在每個皿中(使用 8 管吸量管)；2) 50l 的浮在 表層隨後加入細胞中像圖 2 一樣。因此，兩個八皿欄用模擬容量，其他 660 nm、820 nm、870 nm、和 880 nm，每個浮在表層物共 16 個皿。每個小盤子設定各自的

13、經過巨噬細胞照射設定後時段，如：0 時間，12 時， 36 時，60 時，84 時，108 時，132 小時，共七個時段。圖 2：96 個小玻片顯示不同組別測試位置在每個時段最後，準備讀取相對應盤子的光譜圖如下列： 1. 移走覆蓋纖維組織母細胞的培養液 2. 用硼酸鹽沖洗緩衝 3. 100 微升 100%的甲醇加到每一個皿，放 4 分鐘以固定細胞4. 除去過量的甲醇，暴露在空氣中待乾 5. 100 微升的藍亞甲基加到每個皿，放 30 分鐘 6. 除去過量的藍亞甲基，每個皿用硼酸鹽沖洗 3 遍 7. 用 100 微升的酒精酸加到每個皿中，搖動以確保混合小盤子放在八管的 Multiskan 光譜儀

14、，以 650nm 來讀取每個皿中內容物的吸 收。小盤子經過光譜儀讀取後，對照標準曲線讀取吸收度，以獲得每個細胞經 過每一個處理時段後的數目。結果結果Trypan blue 可存活性的排除測試結果顯示，12 小時處理後的 U-937 細胞數 維持存活量，範圍在 93 到 96%之間，細胞數下降歸因於所受的處理並不具有統6計上的顯著性。纖維組織母細胞增殖的效果從 U-937 細胞在 RPMI 照射中獲得，不同的波 長顯示於表 1 並繪製於圖 3。獲得最大的刺激量是 660 nm 非同調光，發現 820 nm（同調且極化）和 870 nm（非同調）也有刺激作用，雖然程度較小。相反的， 浮在表層的獲得

15、經過 880 nm 非同調光的照射，在纖維組織母細胞增殖有抑制的 效果產生，統計分析的比較結果在表 2a-2f。從 U-937 細胞在 PBS(圖 4)的照射下獲得浮在表層效果，不顯著異於在 RPMI 照射下的 U-937 細胞。經 RPMI 處理但無 U-937 也會影響到纖維組織母細胞的增殖，雖然層度上 較有 U-937 者為低（圖.5） 。RPMI 吸收的特性展示於圖 6。在實驗所述的使用波長範圍內（如 660-880nm） ， 幾乎沒有吸收發生。巨噬細胞對光線療法的增殖反應摘錄於圖 7。暴露在各種波長光線下的巨噬細 胞組其數目和假或模擬照射的控制組，在照射 12 小時時段後所取得的懸浮

16、物並 無顯著差別，然而在各種波長光線照射 36 小時後有短暫的剌激作用。巨噬細胞光線療法反應 表 1：每次治療後纖維組織母細胞數量模擬(Mock) 浮在表層每一次纖維組織母細胞數量 (Fibroblast no. per supernatant) 移植後時數(Hours after plating)7圖 3：模擬治療、660 nm、820 nm、與 880 nm 各組經過裝盤後維組織母細胞數 量(千) 變化圖圖 4：各測試組經過裝盤後維組織母細胞數量(千)( U-937 細胞在 PBS 光源照射 下) 討論討論這些結果指出，U-937 細胞在試管中以特定波長光線照射下，可以改變它 們影響纖維組織母細胞增殖的能力，改變的類型和等級經發現取決於使用的光 的波長，在 RPMI 分散光線照射下的 U-937 細胞，波長 660 nm 製造最大的刺激 效果，波長 820 nm（同調且極化的）和 870 nm（不同調的）能製造刺激效果但 等級較小，相對來說，照射非同調的 880 nm 的 U-937 細胞會對