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1、l目 录题 目摘要及关键词1 前 言12 材料和方法12.1 材料.22.2 方法与结果.22.2.1 色谱条件22.2.2 对照品溶液的制备22.2.3 样品溶液制备32.2.4 线性关系考察32.2.5 精密度实验32.2.6 稳定性实验32.2.7 重复性实验42.2.8 加样回收率实验42.2.9 样品测定43 讨论4参考文献5致 谢6lRP-HPLC 同时测定桔梗中去芹糖桔梗皂苷同时测定桔梗中去芹糖桔梗皂苷 D 与与桔梗皂苷桔梗皂苷 D 的含量的含量学 生:专 业: 指导教师: 摘摘 要要：为了更加科学、准确地控制中药桔梗的质量，建立了同时测定桔梗中去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D
2、 含量的反相高效液相色谱法。桔梗用 70乙醇超声提取，采用Hypersil ODS2 色谱柱（250 mm4.6 mm, 5 m） ，乙腈/水为流动相，流速 1.0 mLmin-1；检测波长 210 nm，柱温 30 ，以外标法检测。去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 可以达到基线分离，平均回收率分别为 97.81%和 98.22%。首次报道了反相高效液相色谱同时测定桔梗中去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 的含量测定方法，该方法操作简单，结果稳定可靠，可作为中药桔梗的质量控制依据。关键词关键词：桔梗; 去芹糖桔梗皂苷 D; 桔梗皂苷 D; RP-HPLCRP-HPLC Simultaneou
3、s Determination of Deapio-Platycodin D and Platycodin D in Platycodi Radix Name: Tong Yun Major: Traditional Chinese Medicine Supervisor: Li WeiAbstract: In order to effectually control quality of Platycodi Radix, we carried out simultaneous determnation of deapio-platycodin D and platycodin D from
4、Platycodi Radix by RP-HPLC. The samples were extracted with 70%EtOH, and then analyzed on a Hypersil ODS2 chromatographic column (250mm4.6 mm, 5 m) with acetonitrile and water as mobile phase. The wavelength is 210nm and column temperature is 30. The deapioplatycodin D and platycodin D were separate
5、d well, and their average recoveries were 97.81% and 98.22%, respectively. We investigated simultaneous determination of deapioplatycodin D and platycodin D in Platycodi Radix by RP-HPLC for the first time. This method possessed simple operation and stable results, which can be used for quality cont
6、rol of Platycodi Radix.Key words: Platycodi Radix; Deapio-platycodin D; Platycodin D; RP-HPLC. l1 前前 言言桔梗为桔梗科(Campanulaceae) 多年生草本植物,又称紫花桔梗,全世界仅1种1变种,生产中有3个栽培变种,即白花桔梗、黄花桔梗和粉花桔梗1，2。其根是常用中药,具有宣肺利咽、祛痰排脓之功效。桔梗的主要成分为齐墩果酸型五环三萜皂苷,同时含有黄酮、聚炔、甾体、酚酸、脂肪酸等类型的化合物35。由于皂苷是桔梗中的主要活性成分,桔梗中皂苷类化合物含量的准确测定,将对探索桔梗中有效成与其疗效间
7、的关系和中草药质量标准现代化具有一定意义。中国药典中对桔梗总皂苷含量的测定采用重量法6,也有分光光度法、电化学法和色谱法的报道712 。关于色谱法测定,国内研究大多只限于桔梗皂苷D ,其它皂苷测定的报道很少8，9。而国外有测定多种皂苷的报道,但样品处理复杂且分离时间长11，12。据报道：桔梗中含有大量的五环三萜皂苷类成分，其中桔梗皂D(platycodin D)一直被作为桔梗质量控制的指标性化合物13，也有学者报道了不同来源桔梗中桔梗皂苷E的 HPLC-ELSD测定14。作者在桔梗的化学成分研究中，去芹糖桔梗皂苷D(deapio-platycodin D)作为主要皂苷类成分被分离得到15。药理
8、研究表明：去芹糖桔梗皂苷D具有抑制胰脂肪酶活性及抗肿瘤活性16，17。查阅有关文献，虽然桔梗中桔梗皂苷D的HPLC分析已有报道1820，但去芹糖桔梗皂苷D的分析测定尚未见报道。为了更加科学、准确地控制桔梗质量，本文应用RP-HPLC对不同商品桔梗中二者含量进行了定量分析，结果令人满意，可作为中药桔梗质量控制的依据。2 材料和方法材料和方法2.1 材料Agilent1100系列高效液相色谱仪(G1322A DEGASSER) 美国惠普Agilent1100 系列高效液相色谱仪(G1311A QuatPump) 美国惠普Agilent1100 系列高效液相色谱仪(G1318A COLCOM) 美国
9、惠普Agilent1100 系列高效液相色谱仪(G1314A VWD) 美国惠普去芹糖桔梗皂苷 D 和桔梗皂苷 D 对照品(纯度均在 98.5%以上) 实验室自制商品桔梗饮片分别购自吉林大药房、福百草大药房和永新大药房，商品标注产品分别为吉林安图（NO.2008062301, 2008062302, 2008062303） ，山东济南（NO.2008092101） ，陕西商洛（NO.2008101101,2008101102） ，均经吉林农业大学郑毅男教授鉴定；l乙腈为色谱纯 美国 Fisher 公司纯水 娃哈哈公司其他试剂为分析纯 北京化工厂 2.2 方法与结果2.2.1 色谱条件 Hype
10、rsil ODS2 色谱柱（250mm4.6mm, 5m） ；流动相：A:乙腈, B:水，梯度洗脱：020 min， A 由 15%线性变化到 22%；2040 min，A 由 22%线性变化到 25%。流速 1.0 mLmin-1；检测波长 210 nm，柱温 30 ，色谱图见图 1。2.2.2 对照品溶液的制备 去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 于真空干燥器中干燥 48 h 后，分别精密称取 6.0 mg 和 9.6 mg，用流动相（15%乙腈）溶解，并定容于 10 mL 容量瓶中作为对照品溶液，其质量浓度分别为 0.6gL-1和 0.96 gL-1，吸取一定量过 0.45 m 滤膜，备
11、上机用。A.对照品; B.样品 (NO. 2008062302); 1-去芹糖桔梗皂苷D; 2-桔梗皂苷Dl图图1 对照品与桔梗样品对照品与桔梗样品HPLC图图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance (A) and samples (B)2.2.3 样品溶液制备 商品桔梗饮片粉碎过 40 目筛，准确称取干燥恒重后的桔梗粉末 1.0 g，于 50 mL离心管中加入 70%乙醇 25 mL，冷浸 12 h 后，超声波提取 3 次，每次 30 min，合并提取液，减压浓缩至浸膏，用流动相（15%乙腈）于 5.0 mL 容量瓶中定容。取适量，过0
12、.45 m 滤膜，备上机用。2.2.4 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液 5.0, 7.5, 10.0, 15.0, 20 L, 注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 峰面积的积分值。以进样量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲线，求回归方程。去芹糖桔梗皂苷D：Y2.0210-2X+3.57 (R2=0.999 8)；桔梗皂苷 D：Y1.5310-2X-7.95 (R2=0.999 8)，表明去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 分别在 3.012.0 g 与 4.819.2 g 范围内呈良好线性关系。2.2.5 精密度实验 分别精密吸取对照
13、品溶液 20 L，连续进样 5 次，测定峰面积。结果去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 峰面积的 RSD 分别为 1.01%和 0.95%（n5） ，表明本方法精密度良好。2.2.6 稳定性实验 分别精密吸取样品溶液 20 L，分别在 0，4，8，12，24 h 后测定，结果去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 峰面积的 RSD 分别为 1.56%和 1.35%，表明样品溶液在制备24 h 内测定是稳定的。表表 1 不同商品桔梗饮片中去芹糖桔梗皂苷不同商品桔梗饮片中去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷与桔梗皂苷 D 含量含量（n=3） Table 1 Contents of deapio-platyc
14、odin D and platycodin D in different Platycodi RadixNO.去芹糖桔梗皂苷 D/%RSD桔梗皂苷 D/%RSD20080623010.1381.210.2291.3520080623020.1961.050.2011.1920080623030.1450.960.2781.0320080921010.1131.180.2331.1520081011010.1250.980.2111.0020081011020.1461.310.2691.27l2.2.7 重复性实验 取同一桔梗样品（NO. 2008062301） ，按照 2.3 项下方法制备
15、5 份样品溶液，依照同样色谱条件测定去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 峰面积，结果样品中去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 平均含量分别为 0.131%和 0.232%，RSD 分别为1.32%和 1.26%(n5)，表明重复性良好。2.2.8 加样回收率实验 称取已知含量的样品 5 份，每份 1.0g 左右，置 50 mL 离心管中，各精密加入对照品溶液 1.0 mL，按 2.3 项下制备样品溶液，依上述色谱条件测定去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 峰面积，计算二者平均回收率，结果平均回收率分别为 97.81%和 98.22%，RSD 为 1.45%和 1.13% (n5)。2.2.9 样品测定 分别精密吸取对照品溶液和样品溶液各 20 L，注入高效液相色谱仪，按 2.1项下色谱条件测定(n=3)，计算峰面积积分值，以外标法计算样品中去芹糖桔梗皂苷 D 与桔梗皂苷 D 含量，不同商品桔梗饮片测得结果见表 1。3 讨论桔梗皂苷系具有双糖链的五环三萜齐敦果酸型皂苷，大都连接 56 个糖基，极性较大且分离困难。曾有学者报道桔梗皂苷 D 对照品的分离制备工艺，并提供给国内多家科研单位作为对照品使用。从以往桔梗皂苷类
