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1、毕业设计（论文）毕业设计（论文）（ 20 届本科）届本科）题题 目目：中国沿海日本鳗鲡遗传关系的中国沿海日本鳗鲡遗传关系的 D-loopD-loop 分析分析学学 院：生命科学与技术学院院：生命科学与技术学院专专 业：水产养殖业：水产养殖班班 级：（级：（3）班）班姓姓 名：名： 学学 号：号： 指导教师：指导教师： 20 年年 5 月月目 录摘要：2前言21材料和方法 21.1 样品采集21.2 总 DNA 提取 .21.3 D-loop 基因片段的 PCR 扩增 .21.3.1 引物设计21.3.2 PCR 扩增 21.4 序列测定及数据分析22结果与分析 22.1 DNA 提取 22.2
2、 PCR 扩增结果 22.3 序列变异22.4 种群结构变异22.5 系统关系23 讨论231 鳗鲡种群遗传结构和变异23.2 系统关系2谢辞：2参考文献(References ) :.2中国沿海日本鳗鲡遗传关系的中国沿海日本鳗鲡遗传关系的 D-loopD-loop 分析分析摘要摘要： 对 2009 年采集自中国沿海地区 10 个采样点、共 119 尾玻璃鳗的日本鳗鲡样本的遗传多样性进行 D-loop 分析。对控制区 980 个碱基进行分析。群体内遗传变异和群体间遗传变异对群体总遗传变异的贡献率分别为 97.99%和 2.01% ，十个采样群体两两间的遗传分化指数在-0.035540.1200
3、9 之间。九段沙鳗鲡和其他群体之间可能存在相当的遗传分化，可能与采样时间有一定关系。而遗传分化指数及 NJ 树分析结果一致表明：群体之间的遗传分化不明显。在玻璃鳗采样群体未发现遗传差异同采样地点有显著关系，显示它们可能同属一个大混合群体。关键词关键词：日本鳗鲡；线粒体 DNA；D-loopGenetic Relationship of Japanese eel (Anguilla japonica)from the Chinas Coastal by D-loop AnalysisAbstract：Collected in 2009 from 10 sampling points in coa
4、stal areas in china, a total of 119 samples of glass eels of Japanese eel were duplicated for the D-loop analysis of genetic diversity. a total of 980 loci were amplified. The respective average genetic diversity index of the ten sample points of there are between every two sampling groups, genetic
5、differentiation indices are from -0.03554 to 0.12009. the respective contribution rates of intra-cluster Genetic variation and genetic variation among populations of the group were 97.99% and 2.01%. in the process of glass eel samples, genetic differences had no significant relationships with sampli
6、ng points and months.it is indicated that they may belong to a large mixed group. The genetic differentiation index and the NJ tree analysis results are consistent with that: The genetic differentiations between groups are not obvious.Key words: Anguilla japonica; mitochondrial DNA;D-loop前言前言日本鳗鲡(An
7、guilla japonica Temmet Sch1)，属于降海产卵的洄游性鱼类，其生活史中包括了深海中产卵、孵化,然后至淡水湖泊和沿海成长的过程。卵孵化后随海流漂送，经柳叶鱼期的变态行为，而达到河口成为透明的“鳗线”，再顺着涨潮溯河而上成长。1肉食性，以小鱼及底栖生物为食物。日本鳗鲡营养丰富，味道鲜美，天然苗种和人工养殖主要分布在太平洋西部的一些亚洲地区，是这些地区目前人工养殖和出口创汇的重要水产品之一。到目前为止，日本鳗鲡规模化的人工育苗依然没有成功，其苗种全靠天然捕捞，这就使人们对其自然资源、种质、遗传分化情况十分关心，鳗鲡专家指出“世界天然鳗鱼资源急速减少，意味着鳗苗产量剧降，值得重
8、视” 。因此开展日本鳗鲡种质资源的研究，提出合理的开发利用的方案是迫在眉睫的工作。中国是世界上日本鳗鲡的主要产苗国，占全世界产量的一半以上，而长江鳗苗产量又占全国的六成以上，因而，通过对长江日本鳗鲡遗传多样性的分析，可以较好地掌握目前日本鳗鲡的资源状况。2线粒体DNA母系遗传, 具较高突变率, 突变固定后形成的多态性位点可反映出群体遗传特征、种群分化和种属关系等特点, 是系统进化和种群遗传研究的理想材料。控制区是线粒体上一段非编码区, 进化速率快, 变异程度高, 是探讨近缘种间和种内遗传变异的良好指标。控制区(D-loop区)是mtDNA上的一段非编码区,由于受选择压力小,在进化过程中积累了较
9、多变异, 因而被认为是线粒体基因组上进化最快的部分之一, 通过检测该区域的DNA 变异可以有效地鉴别亲缘关系较近的群体。本研究即选用线粒体DNA控制区(D-loop)基因片段作为标记,对日本鳗鲡进行了遗传多态性的初步研究。31 1材料和方法材料和方法 1. 1 样品采集本实验所用鳗鲡样本，全部采自野生群体的玻璃鳗。采集情况具体如表1所示。表 1. 采样信息采样地点采样时间样本数量/尾新会(XH)2009-1-2111汕头(ST)2009-1-2313厦门(XM)2009-1-2412福清(QF)2009-1-2512宁德(ND)2009-1-2512玉环(YH)2009-3 -712台州(TZ
10、)2009-3-712慈溪(CX)2009-2-711上海九段沙(JDS)2009-4-1012大丰(DF)2009-2-28121. 2 总DNA 提取基因组DNA提取采盐析法, 操作过程如下:(1) 将组织样本剪碎放入灭菌的离心管中，50下烘干酒精；(2) 每管中加入420l STE（PH=8.10），80l 10%SDS(PH8.14),10l蛋白酶K（20mg/ml）；(3) 放入56烘箱中消化一夜（大约12-14h）；(4) 加300l饱和NaCl溶液，混合均匀；(5) 加氯仿340l，轻摇混匀；(6) 室温12000rpm，离心20min；(7) 将上清液移入另一干净的离心管中（D
11、NA位于上清夜中）；(8) 加入500l预冷（-20）的异丙醇；(9) 4 13000rpm,离心20min；(10)倒掉上清液；(11)加入800l 75% -20的酒精，混匀；(12) 4 13000rpm,离心15min；(13)倒掉酒精，烘干（37 1525min）酒精；(14)加双蒸水300l，加RNA酶1l备用。1. 3 D-loop基因片段的PCR扩增 1.3.1 引物设计根据已报道的日本鳗鲡线粒体DNA全序列(GenBank序列号NC_010288) 4，设计引物。其中扩增D-Loop区的引物为：DL-F：5- GCA TCG GTT TGT AAT CCG -3和 DL-R:
12、 5-GGG GAT ATA GGG CAT TCT CA -3。测序引物为：DL-F：5- GCA TCG GTT TGT AAT CCG -3，5-GGCATAAAATGAACTATTAC-3。 1.3.2 PCR扩增PCR扩增采用50L的体系，包括：上/下游引物各（5）：1.5L、DNA模板150-200ng、2PCR Mix 25L (0.1U Taq 酶 500M dNTP each, 20mM pH8.3 Tris-HCl, 100mM KCl,3mM MgCl2 )、H2O PCR扩增程序： 94C 5min、94C 30s、53C 30s、72 C 1.5 min，30个循环，
13、最后72C 延伸10min将PCR产物进行1.5%的琼脂糖电泳检测产物的浓度和纯度，对于检测结果比较理想的直接送交生工测序(生工测序之前进行纯化和克隆后)。1. 4 序列测定及数据分析采用 BioEdit 软件5对序列进行编辑，用 ClustalW 软件6进行序列重排并进行人工校正。用 Arlequin 3.01 软件7计算群体的单倍型多样性（h）和核苷酸多样性（），以及分子方差分析（AMOVA）8和 Tajimas D值9检验，碱基组成、转换数/颠换数、变异及缺失位点。MEGA 3.1 软件10分析序列并用邻接(Neighbor-joining, NJ) 11 法构建基于 Kimura 2-
14、parameter(K-2p)模型12的系统发育树。2 2 结果与分析结果与分析2.1 DNA提取DNA 的提取成败是实验的关键，本实验采用饱和 NaCl 方法提取。图 1 示鳗鱼群体部分 DNA 的琼脂糖电泳图。从图中可看出各群体 DNA 条带清晰，明亮，几乎没有拖尾，表明所含的蛋白质和 RNA 等杂质非常少；电泳 1 小时后 ，DNA 条带滞留在上样孔附近，说明提取的 DNA 片段较完整，DNA 很少有发生降解，质量较好。图 1 日本鳗鲡基因组 DNA 电泳图2.2 PCR扩增结果图2为线粒体D-Loop区的PCR扩增电泳检测图，从图中可以看出D-Loop区为1000bp左右，扩增条带单一
15、，无杂带。图2 日本鳗鲡线粒体D-Loop区PCR产物电泳图2.3 序列变异本实验共测序了119尾个体的D-Loop区序列。经序列比对，日本鳗鲡线粒体控制区序列中A、T、G、C四种碱基的组成分别为: A+T含量高于G+C含量，A、T含量较为接近，符合脊椎动物线粒体DNA基因片段组成的特点。表2 日本鳗鲡各群体控制区基因碱基组成群体CTAGXH19.51%28.81%38.86%12.82%D200 020001000750 500100200ST19.65%28.69%38.82%12.83%XM19.65%28.68%38.89%12.79%FQ19.61%28.69%38.94%12.76
16、%ND19.61%28.72%38.88%12.79%YH19.56%28.79%38.93%12.72%TZ19.56%28.75%38.90%12.80%CX19.47%28.85%38.93%12.76%JDS19.56%28.82%38.89%12.73%DF19.66%28.66%38.84%12.85%本实验共测序了 119 尾个体的 D-Loop 区序列。在检测序列发现宁德和福清群体的多态位点高达 57 个，玉环群体多态位点最少，为 30 个；九段沙群体内的 FST 值最高为 0.03879，而宁德群体的 FST 值只有0.00307（表 3）。表 3 日本鳗鲡各群体多态位点、置换位点、缺失位点、转换/颠换位点大小群体样本数多态位点转换/颠换缺失位点FSTXH115036/2120.01215ST135341/580.013
