（毕业设计论文）《果胶酶产生菌的筛选及其条件优化》

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1、实验序号实验 7实验名称特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究（一）实验时间2011.11.15-12.15实验室118 一、实验目的一、实验目的： 1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法； 2、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会运用微生物生态知识分离产酶微生物；3、掌握果胶酶活性测定的原理，学会果胶酶活性的测定方法； 4、了解酶学性质的研究。二、二、 实验原理实验原理1、果胶质：果胶是植物中的一种酸性多糖物质，它通常为白色至淡黄色粉末，稍 带酸味，具有水溶性，工业上即可分离，其分子量约 5 万30 万，主要存在于 植物的细胞壁和细胞内层，为内部细胞的支撑物质。

2、果胶质是一类高分子碳水化 合物，普遍存在与高等植物的细胞壁及细胞壁间作为结构物质。2、果胶酶：分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、 果胶酸酶。通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶 酶作用下，转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团， 生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。 细菌、放线菌、酵母菌和霉菌都可以发酵产生果胶酶，但是目前商品果胶酶主要 来自于霉菌。果胶酶主要用于果胶的分解，在水果的加工、葡萄酒的生产、麻类 脱胶和饲料方面。3、果胶酶的酶活测定方法： 、粘度降低法：利用粘度计测量一定温度、酶

3、浓度和一定反应时间内，标准 果胶溶液的粘度降低值。 、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。 、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活 力。 、还原糖法（DNS 法）：测定在一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的 量。根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸是一种还原糖，与 3，5-二 硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量 和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在 540nm 进行测定。4、影响微生物发酵的因素有很多； 、培养基的成分（营养物质及其浓度）例如：碳源的种类、氮源的种类、 碳源的浓度、氮源的浓度、无机盐

4、、水含量等； 、菌种接种的量； 、发酵条件：温度、PH、溶解氧等； 、附加条件：诱导物、表面活性剂等 （5） 、酶催化反应的进行也受到多方面因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、 PH、激活剂、抑制剂。 （6） 、果胶酶的最适催化 PH 为酸性，在 3.5 左右，而 DNS 的显色 PH 为碱性。三、实验设备及材料：三、实验设备及材料：1、实验设备：天平、灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、电磁炉、恒温水浴锅、 计时器（精确到秒） 、分光光度计、离心机、烘箱、PH 计数器。 2、实验用具：烧杯、三角瓶、试管、移液枪（枪头） 、量筒、容量瓶、试剂瓶、 研钵、试管架、玻璃棒、纱布、绳子、离心管、比色皿、

5、培养皿。 3、实验试剂： 、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸 15.652 克，柠檬酸钠 7.5 克，溶 解定容至 1000ml，用 0.1M NaOH 或 0.1M HCl 调节 PH 至 3.0。 、底物0.25%果胶溶液：称取 0.25g 果胶，用 PH=3.0 的柠檬酸-柠檬 酸钠缓冲液溶解，在电磁炉上加热至完全溶解，用缓冲液定容至 100mL，储存 于 4 ，7 天内有效。 、DNS 试剂：称取酒石酸钾钠 182.0g，溶解于 500mL 水中，加热（不超 过 50） ，于热溶液中依次加入 2，5-二硝基水杨酸 6.3g，氢氧化钠 21.0g，苯酚 5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后

6、定容 1000mL，储存于棕色瓶中，室温保存，7- 10 天后过滤使用。 4、实验材料：从周围环境采集的土样或腐烂的水果上的霉菌。 5、培养基：、基本培养基；成分及条 件果胶磷酸二氢钠蛋白胨琼脂pH含量及水 平1%0.5%1%2.0%4.5、分离培养基； 成分及条件果胶磷酸二氢钠琼脂pH含量及水平0.5%0.5%2.0%4.5、发酵培养基； 成分及条件果胶磷酸二氢钠蛋白胨pH 含量及水平1%0.5%1%4.5 、种子培养基； 成分及条 件麸皮橘子粉硫酸铵葡萄糖磷酸二氢 钾pH含量及水 平3.0%2.0%0.5%1%0.1%4.5、固体发酵培养基； 成分及条 件麸皮橘子粉硫酸铵葡萄糖水含量及水

7、平10g2.5g0.1g0.125g15mL四、实验步骤四、实验步骤（一）（一） 、半乳糖醛酸标准曲线的绘制；、半乳糖醛酸标准曲线的绘制；1、先配制一系列浓度不同的标准曲线溶液，用选定的显色剂进行显色。 （1） 、精确称取 0.100g 半乳糖醛酸，用缓冲液定容至 100mL，制得浓度为 1mg/mL 的半乳糖醛酸的标准溶液。 （2） 、如下表配制溶液； 半乳糖醛 酸溶液体 积0.00.20.40.60.81.01.2半乳糖醛 酸0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液 (ml)2.01.81.61.41.21.00.8DNS(ml)3333333定容总体 积(ml)202020202

8、02020OD(540n m)0.0000.0850.2410.4050.5500.7030.850（3） 、在 540nm 波长的光下测定他们的吸光度 A。 （4） 、以 A 为横坐标，浓度 c 为纵坐标，做出标准曲线。00.511.500.20.40.60.81标标准准曲曲线线y = 1.3623x+0.0484O OD D值值半半乳乳糖糖醛醛酸酸浓浓度度系列1 线性 (系列1)（三）（三） 、菌种的准备：、菌种的准备： 1、照种子培养基的比例称好各物质，并进行灭菌，冷却后待用。 2、将从步骤（三）中得到的周围透明圈较大的菌落在超净工作台中接种到种子 培养基中。 （选出几个菌种就接种几瓶）

9、（四）（四） 、菌种的选择、菌种的选择(我们组选择出的菌种为霉菌我们组选择出的菌种为霉菌)： 1、配制发酵培养基（本组在菌种的选择时采用液体发酵）并灭菌，数量根据所 选出的菌的数量来定（本组选出了 5 个菌种，所以配制了 5 瓶） 。 2、将灭好菌的培养基取出冷却后在超净工作台内编好号（k1,k2,k3,k4,k5,）并接 入对应的菌种 5%。 3、在 30的恒温摇床内培养 48 小时。 4 取出后在超净工作台内各吸取 10ml（5ml）发酵液于对应编号的离心管内在离 心机内离心 5min。 5、取 15 支试管分别标上 1 空、1A、1B，2 空、2A、2B5 空、5A、5B，并 每支试管加

10、入 1.8ml 0.25%的果胶溶液置于 37的恒温水浴锅中预热 5min。 6、取离心好的上清液分别在其数字对应的 A、B 试管内加入 0.2ml 上清液，注 意，空白管不加。 7、加好后精确计时 30min，当时间到时，向每支空白管内分别加入对应序号的 离心管内的上清液，同时加入 1ml40%的 NaOH 与 3mlDNS 试剂终止反应。 8、将所有的试管取出再沸水浴 5min。取出后流水冷却。 9、向每一支试管内加入 14ml 蒸馏水并震荡使其混合均匀。 10、用分光光度计在 540nm 的波长的光下以空白管为对照测定 A,B 管的反应液（二）（二） 、果胶酶产生菌的筛选分离；、果胶酶产

11、生菌的筛选分离； 1、按照上方所说的基本培养基比例称取各组分，称好后将其煮沸溶解。 2、灭菌，将煮好融化后的培养基倒入三角瓶内，用 8 层纱布，一层油布纸和两层 报纸包扎好后置于灭菌锅内灭菌 40 分钟。 3、倒平板，将灭好菌的培养基取出，趁热在超净工作台内将其倒入适量于灭过菌 的培养皿内（10ml 左右） ，待其冷却后凝固备用。 4、接种，将采集的土样晾干（本组使用土壤，来自于腐烂柿子下方的土壤） ，然 后取适量在研钵中研磨细，用食指蘸取少量，在上述倒好的平板上用拇指轻搓一 下，使其均匀的洒落在平板上。 5、培养，将接种后的平板用报纸包好，将其置于恒温培养箱内培养 36 个小时。 6、再按照

12、上述分离培养基配方称取各种成分并煮化后置于灭菌锅内灭菌 40min， 然后倒平板，冷却凝固备用。 7、将基本培养基取出，在超净工作台内用接种针从中挑取菌在配制好的分离培养 基平板上划线分离（可以挑取不同的菌落在不同的平板上划线分离） 。 8、包扎好后置于恒温培养箱内培养 36 个小时。 9、取出继续划线分离直到得到单一菌落为止。 10、找出周围透明圈较大的菌落作为菌种。的吸光度，并计算出酶活，选出产酶最高的菌种作为以后条件优化的实验菌种。（五）（五） 、果胶酶产生菌发酵产酶条件的优化：、果胶酶产生菌发酵产酶条件的优化： 1、氮源的选择：（使用固体发酵） （1） 、配制固体发酵培养基 3 份并将

13、氮源分别改为硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏并按 照 1%的浓度替换发酵培养基中的蛋白胨； （2） 、于高压灭菌锅中灭菌 40min，取出冷却后接种 5%的选择出的菌种； （3） 、在 30的恒温培养箱中培养 48 小时； （4） 、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内 烘干（温度不宜太高，否则会使酶失活） ； （5） 、各取出烘干的酶曲称取 1g 于一试管中并加入 19ml 缓冲液将其稀释 20 倍 后于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清（注意做好标记） ； （6） 、取 3 支离心管分别标记上“1（硫酸铵） ” 、 “2（蛋白胨） ” 、 “3（牛肉膏） ” 并加入上方对

14、应氮源添加后发酵得到的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心 5min； （7）取 9 支试管分别标记为“1 空、1A、1B，2 空、2A、2B，3 空、3A、3B” 。 并分别加入 1.8ml0.25%的果胶溶液。于 37的恒温水浴锅中预热 5min； （8）向除了空白管以外的其他几支管加入 0.2ml 离心后的上清液（酶液） ，然后 精确计时 30min； （9）向空白管内分别各加入 0.2ml 的酶液同时每只管个加入 1ml 40%的 NaOH 溶液与 3ml DNS 试剂终止反应； （10） 、取出各管并沸水浴 5min,取出后流水冷却并分别加入 14ml 蒸馏水后混匀；（11） 、以空白管

15、对照用分光光度计测定 540nm 下的吸光度并计算酶活； （12） 、选出最佳氮源。2、氮源浓度的优化： （1） 、配制固体发酵培养基 5 份并将氮源浓度分别改为 0.5%（1） 、1.0%（2） 、 1.5%（3） 、2%（4） 、2.5%（5）替换发酵培养基中的蛋白胨； （2） 、于高压灭菌锅中灭菌 40min，取出冷却后接种 5%的选择出的菌种； （3） 、在 30的恒温培养箱中培养 48 小时； （4） 、取出发酵完毕的培养基并各从中取出适量的一块酶曲于培养皿中在烘箱内 烘干（45左右） ； （5） 、各取出烘干的酶曲称取 1g 于一试管中并加入 19ml 缓冲液将其稀释 20 倍 后

16、于振荡器上震荡使其混合均匀后静置澄清（注意做好标记） ； （6） 、取 5 支离心管分别标记上“1（0.5%） ” 、 “2（1.0%） ” 、 “3（1.5%） ” 、“4（2%） ” 、 “5（2.5%） ”并加入对应氮源浓度添加后发酵得到的酶曲的稀释液，然后在离心机中离心 5min（或者用纱布过滤） ； （7）取 9 支试管分别标记为“1 空、1A、1B，2 空、2A、2B5 空、 5A、5B” 。并分别加入 1.8ml0.25%的果胶溶液。于 37的恒温水浴锅中预热 5min； （8）向除了空白管以外的其他几支管加入 0.2ml 离心后制得的酶液，然后精确 计时 30min； （9）向空白管内分别各加入 0.2ml 的酶液同时每只管个加入 1ml 40%的 NaOH 溶液与 3ml DNS 试剂终止反应； （10） 、取出各管并沸水浴 5min,取出后流水冷却并分别加入 14ml 蒸馏水后混匀；（11） 、以空白管对照用分光光度计测定 540nm 下的吸光度并计算酶活； （12） 、选出最