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1、 HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY 硕 士 学 位 论 文 MASTERS DEGREE DISSERTATION磺胺类药物残留ELISA快速检测试剂盒的研制Development of ELISA Methods and Kits for Rapid Detection of Sulfadiazine and Sulfonamides Residuesin Edible Animal Products研 究 生： CANDIDATE: Liu Bai Hong 导 师： 教授SUPERVISOR: Professor Bi Dingren 专 业： 预防兽医学
2、 MAJOR: Preventive Veterinary Medicine 研究方向： 兽医微生物与免疫学 FIELD: Veterinary Microbiology and Immunology 分类号 密 级华中农业大学硕士学位论文磺胺类药物残留ELISA快速检测试剂盒的研制Development of ELISA Methods and Kits for Rapid Detection of Sulfadiazine and Sulfonamides Residuesin Edible Animal Products研 究 生： 指 导 教 师： 教 授指 导 小 组： 副教授副教授
3、目 录摘 要I ABSTRACT.III 缩略语表.V 1 前 言1 1.1 磺胺药的结构特征 .2 1.2 磺胺药的作用机理.4 1.3 磺胺药在机体内的代谢.4 1.4 磺胺药的主要危害.4 1.4.1 急、慢性毒性作用5 1.4.2 三致作用5 1.4.3 过敏作用5 1.4.4 耐药菌株形成5 1.4.5 磺胺类药物在环境中的生态毒理5 1.5 药物残留检测的主要方法.6 1.5.1 仪器分析法.6 1.5.2 生物传感器法.12 1.5.3 活体检测法.13 1.5.4 酶抑制法.13 1.5.5 实验室自动化.13 1.5.6 免疫分析法(IA)13 1.6 本研究的目的及意义 .
4、20 2 材料与方法.21 2.1 实验材料 .21 2.1.1 主要仪器21 2.1.2 主要试剂.22 2.1.3 实验动物及细胞22 2.1.4 主要溶液22 2.2 磺胺嘧啶 ELISA 方法的建立与检测试剂盒的研制26 2.2.1 抗磺胺嘧啶单克隆抗体的生产与纯化26 2.2.2 包被抗原的合成29 2.2.3 酶标抗原的合成30 2.2.4 竞争 ELISA 方法的选择31 2.2.5 抗磺胺嘧啶单克隆抗体包被直接竞争 ELISA 方法的建立.32 2.2.6 磺胺嘧啶残留 ELISA 快速检测试剂盒的组装35 2.3 磺胺类药物 ELISA 方法的建立与检测试剂盒的研制37 2.
5、3.1 抗磺胺类药物单克隆抗体的生产与纯化37 2.3.2 包被抗原的合成37 2.3.3 酶标抗原的合成.382.3.4 竞争 ELISA 方法的选择38 2.3.5 抗磺胺类药物单克隆抗体包被直接竞争 ELISA 方法的建立38 2.3.6 磺胺类药物残留 ELISA 快速检测试剂盒的组装38 3.结果与分析.39 3.1 磺胺嘧啶 ELISA 试剂盒39 3.1.1 抗磺胺嘧啶单克隆抗体的生产与纯化39 3.1.2 抗原的合成39 3.1.3 酶标抗原的合成41 3.1.4 竞争方法的选择41 3.1.5 抗磺胺嘧啶单克隆抗体包被直接竞争 ELISA 方法的建立.42 3.1.6 常规包
6、被与微波包被建立直接竞争 ELISA 标准曲线比较.45 3.1.7 重复性、精密度和特异性46 3.1.8 检测限、定量限的确定47 3.1.9 回收率47 3.1.10 ELISA 方法考核49 3.2 磺胺类药物 ELISA 试剂盒.53 3.2.1 抗磺胺类药物单克隆抗体的生产与纯化54 3.2.2 抗原的合成54 3.2.3 酶标抗原的合成55 3.2.4 方法的选择55 3.2.5 磺胺类药物单克隆抗体包被直接竞争 ELISA 方法的建立.55 3.3 小结 60 4.讨论61 4.1 磺胺嘧啶 ELISA 试剂盒.61 4.1.1 单克隆抗体的纯化方法选择61 4.1.2 包被抗
7、原的合成61 4.1.3 酶标抗原的合成61 4.1.4 药物竞争方法选择63 4.1.5 包被方法选择63 4.1.6 样品处理63 4.1.7 ELISA 试剂盒标准曲线标准点的设置.64 4.1.8 酶联免疫吸附测定法64 4.1.9 ELISA 方法先进性和可靠性.65 4.2 磺胺类药物 ELISA 试剂盒.65 4.2.1 人工抗原合成65 4.2.2 包被抗原连接方法的选择65 4.2.3 单克隆抗体在药物残留检测中的应用比较.66 4.2.4 标准曲线的建立.66 4.2.5 载体蛋白的选择66 参考文献68 致 谢.76摘摘 要要本研究通过单克隆抗体的纯化，直接竞争ELISA
8、方法的确立，样品提取方法的优化，直接竞争ELISA标准曲线的建立，动物试验以及与国外同类试剂盒和仪器方法的比较，建立了检测食源性动物产品中磺胺嘧啶和磺胺类药物残留的两种ELISA检测方法，并在此基础上相应地研制出两个快速检测试剂盒。研究结果如下：1、利用本实验室已有的抗磺胺嘧啶单克隆抗体细胞株（SD-4）经复苏、筛选、生产、纯化得到抗磺胺嘧啶单克隆抗体。用重氮化偶联法将磺胺嘧啶（SD）与卵清白蛋白（OVA）按投料摩尔比 2:1 连接制备了包被抗原（SD-OVA），用过碘酸钠法将 SD-OVA 与辣根过氧化物酶(HRP) 按投料摩尔比 1:2 连接制备了酶标抗原(SD-OVA-HRP)。药物竞争
9、试验确定了直接竞争 ELISA 方法；将常规包被与微波包被法从方法的灵敏度、包被时间、包被稳定性进行比较，确立微波包被法。直接竞争 ELISA 试验在 1ng/mL729 ng/mL 浓度范围建立标准曲线方程 y=12.05x+2.2538，线性相关系数 R2=0.995， IC50为 41.7ng/mL。与磺胺间甲氧嘧啶（SMM） 、磺胺对甲氧嘧啶（SMD） 、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺二甲嘧啶（SM2） 、磺胺喹噁啉（SQ）及磺胺甲噁唑(SMZ)的交叉反应率分别为：1.7%、3.1%、0.01%、0.01%、0.01%、3.4%。建立了猪肉、鸡肉、鸡肝、鸡蛋、牛奶中 SD 提取方法，进
10、而研制出 SD 酶联免疫检测试剂盒，在猪肉、鸡肉、鸡肝中定量限为 20g/kg，回收率 70110，批间变异系数100g/kg） 。自制试剂盒同时对空白组和停药的鸡肝脏中 SD 残留量作了检测，空白组测定结果为阴性，停药 1 天后，检测结果由停药 0d 全为阳性突转全为阴性，符合 SD在动物组织中残留休药期。表表 1313 HPLC、ELISA 测定饲喂磺胺嘧啶鸡肉中测定饲喂磺胺嘧啶鸡肉中 SD 含量的比较含量的比较Table 13 Comparison of detection of SD in chicken muscle tissue fromchicken treating with
11、feed containing 500 mg/kg sulfadiazine in HPLC and ELISA methods测定值（ng/ml）测定值（ng/ml）组织喂药时间（d）方法空白组 1 空白组2均值变异系数(%)鸡 1 鸡 2 鸡 3 鸡 4 鸡 5均值变异系数(%)鸡肉0135ELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLC40.8 59.2- 3030 43.935 428.2 14.844 546.7 5.339 31501536.938.511.5496.03526.014126.512.74014.216.516.0917.3 1283.2 1
12、525.8 1033.3 904.9317 1586 2026 978 602904.1 841.7 699.8 860.9 928.21162 2077 1151 2045 2065 900.7 963.9 1395.8 653.9 774.72050 2062 2059 861 878.81132.91101.8846.91700937.81582.123.663.610.529.130.041.0注：“-”表示不予计算表表 1414 HPLC、ELISA 测定停喂磺胺嘧啶鸡肉中测定停喂磺胺嘧啶鸡肉中 SD 含量的比较含量的比较Table 14 Comparison of detectio
13、n of SD in chicken muscle tissue fromchicken treated with feed containing 500 mg/kg sulfadiazine in HPLC and ELISA methods测定值（ng/ml）测定值（ng/ml）组织停药时间（d）方法空白组 1 空白组2均值变异系数鸡 1 鸡 2 鸡 3 鸡 4 鸡 5均值变异系数鸡肉0am0pm1234ELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLCELISAHPLC0 49.6- 2028.8 8.049 4937.6 20.3- 200 25
14、.8- 022.3 21.4- -6.1 52.3- -24.81018.44928.94912.9021.8-29.2-35.014.114.7012.27.018.200.6-32.6-1448.8 155.9 372.7 2904.3 2034.4 1931 848 943 1934 2070.010.2 235.7 371.7 57.8 181.736 261 293 102 20664.1 60.6 89.1 85.9 16133 33 34 37 7538.2 0 0 0 93.439 0 0 0 5933.0 41.7 29.0 48.8 50.7- 29 - - 7- - -
15、19.1 - - - - -1383.21545.2171.4179.692.142.426.319.640.67.23.82-82.938.684.160.143.943.1155.5141.323.3173.6222.5-表表 1515 ELISA 测定停喂磺胺嘧啶鸡肝脏中测定停喂磺胺嘧啶鸡肝脏中 SD 含量含量Table 15 Detection of SD in chicken liver tissue from chicken treated with feed containing 500 mg/kg sulfadiazine in ELISA method测定值（ng/ml）测定值（ng/m
