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1、实验六-综合实验（10个同学为一组） （四）细菌生理生化试验,培养基配制,微生物学实验P243 固体淀粉培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基,试剂和溶液配制,微生物学实验P251 卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、 40% KOH、 5% -萘酚溶液,（一）淀粉水解实验 目的 掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法,（一）淀粉水解实验,实验材料与用具 大肠杆菌、未知菌 固体淀粉培养基、卢戈氏碘液 接种环等,（一）淀粉水解实验,内容与步骤 1、每组2个固体淀粉培养基平板 2、1个平板分成四等分，穿刺接种2个未知菌，同时穿刺接种大肠杆菌作为阳性对照，还有阴性对照（
2、注意在平板的反面相应地方写上菌名或编号） 3、将平板倒置在培养箱中37C培养24小时 4、观察菌生长情况，打开盖子，滴入卢戈氏碘液，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板 5、如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解，为阳性。透明圈大小可初步该菌水解淀粉的能力,实验结果,（一）淀粉水解实验,（二）糖发酵试验,目的 了解糖发酵的原理和在细菌鉴定中的作用 掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法,（二）糖发酵试验,实验材料与用具 大肠杆菌、未知菌 葡萄糖发酵培养基和蔗糖发酵培养基（是液体试管装培养基，内装有倒置的德汉氏小管） 试管架、接种环等,（二）糖发酵试验,内容与步骤 1、每个组葡萄糖发酵培养基和蔗糖
3、发酵培养基（是液体试管装培养基，内装有倒置的德汉氏小管）各3只，1只为阳性对照，另2只做平行试验 2、在试管外壁标明培养基名称和接种的菌名 3、6只试管均放置培养箱37C培养48小时 4、观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡 5、变黄说明产酸，小管内有气泡说明产气,（二）糖发酵试验,实验结果,（三） IMViC实验,目的 了解IMViC实验的原理及其在细菌鉴定中的意义和方法,（三） IMViC实验,材料与用具 大肠杆菌、未知菌 吲哚试验-用蛋白胨水培养基（液体试管装培养基） 甲基红试验-用葡萄糖蛋白胨水培养基（液体试管装培养基） 伏-普（V-P）试验-也用葡萄糖蛋白胨水培养基（液体试管装培
4、养基） 接种环等,1、吲哚试验,1、每组3支蛋白胨水培养基（液体试管装培养基），1支接种大肠杆菌做阳性对照，另2支接种未知菌 2、37C培养48小时 3、取出，向培养基内加3-4滴乙醚，摇动数次，静置1分钟，待乙醚上升后，沿管壁徐徐加入2滴吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛），观察 4、在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性,2、甲基红实验,1、每组3支葡萄糖蛋白胨水培养基（液体试管装培养基），1支接种大肠杆菌做阳性对照，另2支接种未知菌 2、37C培养48小时 3、取出，向培养基内加入2滴甲基红试剂，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性,3、V-P试验,1、每组3支葡萄糖蛋白胨水培养基（液体试
5、管装培养基），1支接种大肠杆菌做阳性对照，另2支接种未知菌 2、37C培养48小时 3、取出，向培养物内加5-10滴40% KOH,然后加入等量（ 即5-10滴）的5% -萘酚溶液，用力振荡，再放入37C保温15-30分钟，以加快反应速度，若培养物呈红色，为阳性。,（三） IMViC实验,实验结果,环境微生物（细菌）分离鉴定过程,取样 稀释 涂布接种 计数、菌落特征观察及挑取优势菌 一般形态鉴定（革兰氏染色、芽孢染色） 生理生化鉴定（淀粉水解试验、糖发酵试验、IMVIC试验）,细菌稀释示意图,人员安排,1、每个班分成6个组，每组12人左右 2、每个组配一种培养基 第1组3个同学配牛肉膏蛋白胨培
6、养基800ml，倒36个平板（每组6个） 第2组3个同学配固体淀粉培养基300ml ，倒12个平板（每组2个） 第3组3个同学配葡萄糖发酵培养基200ml，装18支试管（每组3支） 第4组3个同学配蔗糖发酵培养基200ml，装18支试管（每组3支） 第5组3个同学配蛋白胨水培养基200ml，装18支试管（每组3支） 第6组3个同学配葡萄糖蛋白胨水培养基400ml，装36支试管（每组6支）,人员安排,3、每组配一种试剂 第1组2个同学配甲基红试剂 第2组2个同学配配卢戈氏碘液 第3组2个同学配1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 第4组2个同学配40%氢氧化钾 第5组2个同学配吲哚试剂，准备乙醚 第6组2个
7、同学配5% -萘酚溶液,人员安排,4、实验过程 1）每组选1个组长，跟我去龙湖取样，注意无菌操作。先准备灭菌镊子、10ml带盖离心管、蒸馏水、5支试管、移液管等。 2）拿回实验室做梯度稀释至10-5。取试管编号10-1、 10-2 、 10-3 、10-4 、 10-5 每管取9ml灭菌蒸馏水 取1ml水样入10-1管，吹打几下混匀 取1ml水样入10-1管，吹打几下混匀，以此类推，稀释至10-5 3）3个同学做10-3 、10-4 、 10-5 三个稀释度，每个稀释度做2个平板平行。每个平板取100ul 涂布 静置5-10min 倒置、37C培养24小时,人员安排,4）4个同学进行平板菌落计
8、数，并选定2株优势菌进行标注和染色（革兰氏染色和芽胞染色） 5）2个同学将2株优势菌做淀粉水解试验， 37C培养24小时后负责记录结果 6）2个同学对2株优势菌进行葡萄糖发酵试验，37C培养48小时后负责记录结果 7）2个同学对2株优势菌进行蔗糖发酵试验，37C培养48小时后负责记录结果 8）2个同学对2株优势菌进行吲哚试验，37C培养48小时后负责记录结果 9）2个同学对2株优势菌进行甲基红试验，37C培养48小时后负责记录结果 10）2个同学对2株优势菌进行V-P试验，37C培养48小时后负责记录结果,人员安排,所有试验过程需24人次，即这次综合实验，每个同学都有2次实际操作的机会，具体由组长安排，没操作时在旁边观摩 学习委员把详细的操作名单给我，相应的实验结果也由对应的同学负责（负责结果要真实、可靠；负责将真实的试验结果给小组其他同学） 时间安排：周四接种牛肉膏蛋白胨培养基，周五计数、形态观察、接种糖发酵培养基和IMVIC培养基，下周一观察结果，同时接种淀粉培养基，下周二观察水解试验结果。 各组所用器具，各组负责清洗干净、放好 打扫卫生，实验报告给学习委员,
