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1、动物基因工程理论,刘叶飞、朱远兵 制作,显微注射,转基因鼠,内容提要,一、动物基因的定义 二、对动物基因改造的一般步骤a.获得目的基因b.目的基因与载体的结合c.目的基因导入受体细胞和筛选鉴定,动物基因工程是什么？,动物基因工程，原称遗传工程，是应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，创造新生物物种，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术；或指应用现代化的生物科学和遗传学技术，对动物基因进行操纵或改造的科学工程。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，还包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。,获得目的基因,动物基因工程主要是对动物的基因进行定向的改造，因
2、此DNA重组在动物基因工程中就显得尤为重要。,1.目的基因的获取： a.直接提取法：即将DNA分子打成很多DNA片段,然后从中去找出目的基因 b.反转录法：从动物特定的组织细胞中提取信使RNA，然后利用反转录酶合成相应的DNA片段，最后合成相应的目的基因。,c.氨基酸序列分析法：先得到目的基因产物的蛋白质，然后分析其氨基酸序列，根据密码子制造相应的DNA片段，最后获得基因（制造出的基因片段与实际基因的碱基序列不同）。,目的基因与载体的结合,对载体的解释:载体是一种可将外源DNA片段送入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具，这种工具也是一个DNA分子。,常用的基因克隆载体有三种：质粒，噬菌体和病毒。
3、,质粒一般存在于细菌中,噬菌体是一种细菌病毒，利用其侵入细菌的特性从而将基因导入受体细菌细胞。,病毒载体与噬菌体作用机理类似， 但是其种类繁多， 可以作用于动物，植物。,动物基因工程的工具酶,简介：工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。,限制性内切酶：原本是一类在细菌中存在的保护性酶，它能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制
4、酶),DNA连接酶： 它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。,DNA连接酶的作用过程,载体与目的基因的结合,目的：将外源DNA（目的基因）插入载体，使两种DNA分子连接起来。 方法：1、黏性末端连接法：选择同一种限制性内切酶消化载体和外源DNA分子，可产生相同的黏性末端，这些黏性末端能退火互补（见普通生物学P284），进一步用DNA连接酶将断端封口，即可获得重组DNA分子。,2.平
5、齐末端连接法：用化学合成法、逆转录酶酶促合成法获得的DNA片段或环状DNA片段，以及某些限制酶酶切产生的DNA片段，均为平齐末端。平齐末端一般可用DNA连接酶连接，但所需底物浓度高，连接效率低。因此通常要将平齐末端改造成成黏性末端后再行连接。即人工接头或加尾。,目的基因导入受体细胞和筛选鉴定,目的基因导入受体细胞的具体方法：,1.基因枪法：用火药爆炸或者高压气体加速将包裹了DNA的球状金粉或者钨粉颗粒直接将DNA送入完整的植物组织或者动物细胞中，这一加速设备称为基因枪。,假如你今后在新闻中看到这样的镜头：美国空军的医务人员拔枪开火，将金色“子弹”射向他们自己人的身躯，而士兵们却一副“求之不得”
6、的架势，请不要惊讶因为这是横空出世的基因枪。它射出的决非夺命的子弹，而是救命的DNA疫苗。,2.精子介导法,精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。在母畜所生的后代中，就有一定比例的动物是整合外源基因的转基因动物。同显微注射方法相比，精子介导的基因转移有两个优点：首先是它的成本很低，只有显微注射法成本的110。其次，由于它不涉及对动物进行处理，因此，可以用生产牛群或羊群进行实验，以保证每次实验都能够获得成功。,植物方面的基因导入,2.花粉管通道法：在授粉后向于房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花
7、粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。该方法于印年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的。该法的最大优点是不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握。,3.显微注射法,显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5m）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。,当含有目的基因的动物受体细胞做好后，还需要对重组细胞进行筛选鉴定（其方法不一一介绍），找到能够生产出所需产物的动物细胞，并不断淘汰性状不稳定的动物细胞，从而达到生产或科学研究的要求。,谢谢！,
