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1、11玉米体细胞胚胎功能基因的初步研究玉米体细胞胚胎功能基因的初步研究2孟繁凡1，马宁1，赵玲玲1，单晓辉1，苏胜忠1，李世鹏1，刘宏魁1，李贺1，吴颖1，原亚萍13（1.吉林大学植物科学学院, 长春, 130062）4摘摘 要要 22A 基因属于 TCB1 家族，编码 GTPase 激活因子，与体细胞胚胎的发生密切相关，且只在发育5的胚中特异性表达。本研究从玉米体胚中克隆 Zm22A 基因，并对玉米自交系 Y423 进行遗传转化。结果6表明，以玉米自交系 Y423 体细胞胚胎为受体，利用 Zm22A 基因的干扰载体侵染，获得阳性苗。对 22A7基因的研究为进一步了解玉米体细胞胚胎的发生机理奠定
2、基础。8关键词关键词 玉米；Zm22A；体细胞胚胎；干扰载体9Preliminary Study on the Functional Genes of Maize Somatic 10Embryos11MENG Fan-fan1，MA Ning1，ZHAO Ling-ling1，SHAN Xiao-hui1，SU Sheng-zhong1，LI Shi-peng1，LIU 12Hong-kui1，LI He1，WU Ying*1，YUAN Ya-ping*1. 13（1.College of Plant Science, Jilin University, Changchun, 130062）
3、14Abstract 22A gene belongs to TCB1 family, coding GTPase activating factor, is closely related to the somatic 15embryogenesis, and only specific expression in the development of the embryo. We cloned Zm22A gene from the 16maize somatic embryos, and transferred into maize inbred Y423 by genetic tran
4、sformation in this study. The 17results show that, Somatic Embryos of maize inbred Y423 were trated as explants , We obtained positive plants 18infected by interference vector of Zm22A .The research of 22A gene lays a foundation of further understand maize 19somatic embryos.20Keywords Maize, Zm22A,
5、Somatic embryos, interference vector21作者简介作者简介：孟繁凡（1995），女，河北省张家口人，学士，吉林大学植物科学学院农学专业。Tel：18844502656 E-22mail：；马宁（1990），女，辽宁省朝阳市人，硕士，吉林大学植物学专业。Tel：13578726309 23E-mail：。 吴 颖和原亚萍为本文通讯作者。24基金项目：基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项抗冷转基因玉米新种质新组合培育(2014ZX0800305B)、吉林省科技厅利25用生物技术手段创制高淀粉玉米新种质(20130206011NY)26227玉米不仅是我国十分
6、重要的粮食作物，在医疗、化工等方面的需求也不断增加，对未来玉米的育种28工作提出了更高的要求。传统的育种方法经验丰富，但是育种周期长、遗传背景狭窄，品种更新速度无29法及时满足市场的需求1。目前，分子育种与传统育种的有机结合成为玉米育种的重要研究方向，可以弥30补传统育种的不足，从而更快、更好的培育玉米新种质2。31遗传体系的建立是玉米转基因育种中十分重要的一个环节，大量研究工作证明，利用体细胞胚胎途32径建立的转基因受体系统具有双极性（即芽和根器官可以同时诱导产生）、遗传稳定性好等特点，成为33首选的受体材料。但是，建立一套稳定性好、优良的玉米体细胞胚胎受体系统比较困难，因此挖掘玉米34体细
7、胞胚胎相关的功能基因对于玉米分子育种的研究有重要意义。本实验室已获得玉米自交系35Y412、Y423 体细胞胚胎的诱导及再生方法的专利（专利号：201110024436.0），并克隆大量玉米体细胞36胚胎发生相关基因，如 Zm KHCP、Zm Typ A、Zm ARF-GEP、Zm SUF4 、Zm DRP3A12。37Ozawa 等3利用 mRNA 差显技术，将再生能力相对好的水稻品种 Konansou、Koshihikari 及 38Sasanishiki 近等基因系和再生能力相对差的水稻品种 Koshihikari、Sasanishiki 为材料，分离到与 39Konansou 品种再生
8、能力呈正相关的 Os22A 基因全长 cDNA 克隆，该克隆主要在再生能力相对好的水40稻品种愈伤组织中进行表达，且随着水稻品种再生能力的下降它的表达量也随之降低，且转 Os22A 基41因的再生能力相对差的 Koshihikari 再生能力得到明显的提高。Li 等4研究发现 GTPase 对拟南芥胚胎42发育有重要作用。本研究从玉米体细胞胚胎中克隆胚胎发生相关的基因 Zm22A 并构建其干扰载体，利43用农杆菌对 Zm22A 进行遗传转化，研究 Zm22A 对玉米体细胞胚胎发生的影响，为进一步了解玉米体44细胞胚胎的发生奠定基础。45 1 材料与方法材料与方法461.1 材料材料471.1.
9、1 植物材料48实验室保存的优良玉米自交系 Y423。491.1.2 实验所用菌种及载体50pGM-T 克隆载体购于北京天根公司，大肠杆菌 Top10 由本实验室保存。胚胎发生相关基因 Zm22A51干扰载体图（图 1）35253图 1: pCAMBIA3301-UBI-22A(+)-intron-22A(-)干扰载体图54Figure1: The figure of interference vector pCAMBIA3301-UBI-22A(+)-intron-22A(-)551.2 实验方法实验方法：561.2.1Zm22A 基因克隆57从玉米自交系 Y423 的体胚中克隆胚胎发生相关
10、基因 Zm22A 基因全序列，基因全长 1317bp，编码 58438 个氨基酸。分子量为 50289，等电点为 5.70。引物设计（22A-F/22A-R）如下：595-ggatccCTGGAACGGGCTGGCT-3605-ggtnaccCTCGGTAGGAAACGGAAAATA-3615端酶切位点为 Nco I /Bst EII，将克隆到的 22A 基因片段与 pGM-T 载体连接，构建中间载体 p GM-62T-22A，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。631.2.2Zm22A 基因干扰载体构建64以植物表达载体 pCAMBIA3301 为基础，将克隆好的功能性间隔序列 Zm22
11、A(+)、Zm22A(-)通过限制65性内切酶 BamH I/Acc65 I、Sac I/ Spe I 酶切后，用 T4 连接酶依次将两个片段连入到载体 pTCK303 上，66构成中间载体。用限制性内切酶 HindIII/ Sac I 将包含 UBI 启动子、Zm22A(+)、Rice Intron、Zm22A(-)的67片段酶切，用 T4 连接酶将其连入到 pCAMBIA3301 上，构成干扰载体。对每一步酶切、连接进行 PCR68及酶切检测，将干扰载体命名为 pCAMBIA3301-UBI-22A(+)-intron-22A(-)。691.2.3 体细胞胚胎的获得70取授粉后 12-15
12、d 的玉米自交系 Y423，75%乙醇消毒后在无菌环境中取其幼胚，盾片向上诱导培养71基上进行诱导，诱导出胚性愈伤后进行继代培养（散光），直到得到稳定体细胞胚胎，可用于农杆菌侵72染。733.2.4 农杆菌介导的 Zm22A 的遗传转化474无菌环境中，把生长状态良好的体细胞胚胎置于装有 OD600为 0.6 的携带干扰载体和 pCAMBIA330175空载体的农杆菌 EHA105 菌液的三角瓶中，28、150rpm 振荡培养 20min 后，倒掉菌液，将体细胞胚胎76放在无菌滤纸上，吸干体胚表面的菌液，将体胚接入共培养培养基中，24暗培养 72h；恢复培养两周，77在恢复培养期间注意观察体胚
13、状态，及时处理染菌或褐化的体胚；两周后，转移到筛选培养基上，每 2578天可继代一次，约 2 个月后，可将抗性愈伤组织转移到分化培养基，在光下进行分化培养。791.2.5 阳性植株检测801.2.5.1 PCR 检测：81提取抗性植株基因组 DNA 作为模板，对 bar 基因进行 PCR 检测。空白对照为水，阳性对照为重组82质粒 pCAMBIA3301-UBI-22A(+)-intron-22A(-) 或 pCAMBIA3301。831.2.5.2 PCR-Southern 杂交：84 以阳性植株基因组 DNA 作为模板，进行 PCR 扩增，PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后，然后采用虹8
14、5吸法进行转膜，以 pCAMBIA3301-UBI-22A(+)-intron-22A(-) 为模板，制备 DIG 标记的 Bar 探针，经过预86杂交、杂交、洗膜等步骤后，进行 CSPD 染色，压片 3-5min 后 X-胶片显影，并观察结果。87 2 结果与分析结果与分析88 2.1 Zm22A 基因的克隆及生物信息学分析基因的克隆及生物信息学分析89利用设计的特异性引物，PCR 克隆 Zm22A 基因全序列，通过 1%琼脂糖凝胶电泳，可在1317bp 处观察90到条带。测序结果序列同 Genbank 中报道的水稻 22A 基因序列进行比对，发现其同源性达到了 99%，说明成91功克隆到玉
15、米 22A 基因。玉米体胚发生相关基因Zm22A，属于 TCB1 家族，是 GTPase 激活因子，核苷酸序92列全长为 1317bp，编码 438 个氨基酸6。932.2 农农杆杆菌菌介介导导的的Zm22A 的的遗遗传传转转化化942.2.1 干扰载体构建95Zm22A 干扰载体正反义片段大小均为 278bp，酶切后用 T4 连接酶依次将两个片段连入到载体96pTCK303 上，构成中间载体。然后将包含 UBI 启动子、Zm22A(+)、Rice Intron、Zm22A(-)的片段酶切，97T4 连接酶将其连入到 pCAMBIA3301 上，构成干扰载体。电泳检测结果表明，PCR、酶切的目
16、的片段大98小与预期一致，证明成功构建了 Zm22A 干扰载体（图 2）。599100图 2：干扰载体 pCAMBIA3301-UBI-22A(+)-intron-22A(-)PCR 检测101注: M: DL2000 Marker; 8、9: 干扰载体阳性克隆; 1:阳性对照(质粒); 8:空白对照(水)102Figure 2: PCR detection of pCAMBIA3301-UBI-22A(+)-intron-22A(-)103Note: M: DM2000 Marker;8、9:Positive clones of interference vector；1: positive control (plasmid);8: blank controls (water)1042.2.2 侵染玉米体细胞胚胎105无菌环境中，对T4 代Y423 玉米体细胞胚胎进行遗传转化，其中干扰载体 300 块，空载体300 块。共培106养3 天转入筛选
