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1、系统方法开发,开发方法之前应明确以下各项 分离目的 样品性质和需要的预处理 检测方法 开发分离方法的步骤 选择合适的HPLC方法 开始建立方法 改善分离 检查问题 完善方法,有关样品组分和性质的重要信息,现有组分的数目 组分的结构以及具有的官能团 组分的分子量 组分的pKa 值 样品基质的性质：溶剂, 填充物等 要检测组分在样品中的浓度范围 样品溶解度,分离目的,是分析还是回收样品组分？ 是否以知样品所有成分的化学特性，即是否需要定性分析？ 是否需要解析出样品的所有成分 (例如, 对映异构体, 非对映异构体, 同系物, 低聚物, 痕量杂物)? 如需定量分析，需要多高的精密度？,分离目的,本法需
2、用于几种样品剂型(如原料,制剂, 环保样品等) ？ 未来使用该方法分析的样品数的多少？ 未来使用该方法的实验室拥有的HPLC设备 和技术能力？,样品的性质以及是否要进行预处理,来自不同形态的样品: 可以直接进样的溶液 需要稀释，缓冲，或者加入第二种溶剂的溶液 能溶解在流动相中的固体物 配制样品前应称重 含有能引起柱效损失的物质的样品- 要求萃取或过滤 被分析物中含有不溶物- 要求萃取或过滤,检测方式,根据不同的分离目的需要不同的检测器. 测量单个或少量的化合物时, 理想的检测器应该仅仅对目标物有响应而对其他物质没有响应 高选择性和高灵敏度 对于定性分析和制备色谱, 理想的检测器是通用型的检测器
3、, 这样混合物中的每一种物质都能被检测出来. 并且不需要特别高的灵敏度,检测器,检测器 化合物类型 UV/PDA 最常用的检测器 不适用于烷烃和糖类 RID 通用型检测器 荧光检测器 适用于能产生荧光的物质具有高选择性和灵敏度 电化学检测器 适用于易氧化和降解的化合物 具有高灵敏度和选择性 电导检测器 适用于可电离的化合物，如有机酸 和无机酸 柱前或柱后衍生化,选择一种 HPLC模式,对于大多数的样品，开发方法经常是从反相模式开始的. 离子对反相模式和 正相模式 是第二选择. 具有以下任何性质的样品经常要求一些特殊的条件. 大分子量的样品, 如聚合物, 碳水化合物或蛋白质 含有光学异构体的混合
4、物 (对映体) 含有其他异构体的混合物 含有无机盐的样品,影响 HPLC 分离的反相条件,不同分离条件 优先选择 柱尺寸(长度, I.d.) 15 , 25 cmL x 2 - 6 mmID, 粒径 3-5 um 固定相 C-8 or C-18 流动相溶剂A/B Water/ACN%-B 不定的缓冲液 (化合物, pH, 浓度) 10-100 mM磷酸盐, pH 2-7添加剂 (eg., 离子对试剂, 氨) 阳离子中加 1-20 mM 高氯酸钠 阴离子中加1-20mMTBA(四丁基铵）流速 0.1-2 ml/min 温度 10-60 oC 样品体积 100 ul质量 100 ug,主要HPLC
5、 方法的特性,离子交换模式 流动相：水相，另以缓冲液控制pH 值 色谱柱: 阳离子或阴离子交换柱尺寸排阻色谱 流动相：水 相(凝胶过滤) 有机相 (凝胶渗透) 色谱柱: 二醇基（凝胶过滤用）聚苯乙烯或硅胶（凝胶渗 透用）,分离无机离子 混合物的首选(离子色谱法)，分离核酸和蛋白质以及有关的化合物的良好的选择 . 分离高分子量样品，如蛋白质和聚合物的良好首选，也可用作测量G分子量的分布,次要 HPLC 方法的特性,方法/特点/色谱柱,何时应用此方法,改善分离,两个相邻的峰达到基线分离，其分离度Rs1.5. 对简单混合物，应使分离度Rs2 对含10个或更多成分的样品, 分离度的要求可降到Rs1,开
6、发HPLC方法的分离目的,目的 内容分离度 精密和抗干扰的定量分析要求 Rs 1.5 分离时间 小于5-10 min时，日常工作较理想 定量 含量测定：RSD1%; 要求不高或痕量分 析, RSD5% 压力 最好150 kgf/cm2， 200 kgf/cm2 通常情况（假设是新柱） 峰形 最好是信噪比大的窄峰 溶剂消耗 每个样流动相的消耗量越小越好,检查问题,在方法开发期间，应重视方法引起的问题 柱效下降 谱带增宽 样品的溶剂不适合 高压引起的柱效下降 高压 样品前处理不当 流动相或其PH值不适合,完善方法,方法本身在日常工作中应经受住考验，应适用于所有的有关实验室 HPLC 方法必须严格适
7、合下列标准 精确度 准确度 稳定性 可转移性 方法有效性检查对方法开发来说是非常重要的,开发 HPLC方法的步骤,1.有关样品的信息, 明确分离目的 2. 是否需要特殊的 HPLC步骤、 样品预处理等. 3. 选择检测器和检测器设备 4. 选择LC 方法，进行预实验; 评估分离条件 5. 最佳分离条件 6. 对特殊程序的问题和要求进行检查 7. 对方法进行常规实验室有效性检查,检测器,紫外可见光检测器 (UV/VIS) 光电二极管阵列检测器 (PDA) 荧光检测器 (RF) 电导检测器 (CDD) 示差折光检测器 (RID) 电化学检测器 (ECD) 质谱检测器 (MS) 蒸发光散射检测器 （
8、ELSD）,紫外/可见光检测器,Ein,Eout,A= eCl = - log (Eout / Ein),l,C : 浓度,朗伯比尔定律,(A : 吸收),池,紫外/可见光检测器,样品池,参比池,光电二极管,光电二极管,Ein,Ein,Ein,光栅,D2 / W 灯,l,Eout,朗伯-比尔定律,A= eCl = - log (Eout / Ein),吸收,浓度,线性范围,2.5,光谱图,275 nm,208 nm,275 nm,208 nm,样品池,512 光电二极管阵列检测器,光栅,D2 / W 灯,二极管阵列检测器,一个元件检测一个 波长下的所有吸收,二极管阵列检测器,时间,长波,吸收,
9、色谱图,光谱图,二极管阵列检测器,可以用光谱图对未知峰进行定性. 可以进行峰 纯度的检测,检验分离参数时可使用光谱图,2,3,1,1: 壬二酸,2: 安息香酸,3: 硝基安息香酸,30%,15%,乙腈浓度,min,光谱鉴定,洗提顺序,Peak 1,Peak 2,Peak 3,乙腈,30%,15%,Azelaic acid,Benzoic acid,Nitrobenzoic acid,光谱3点比较法,乙酰水杨酸,down slope,up slope, 峰顶点,荧光检测器,+ hn1,hn2+,*,A,A*,A,hn1,hn2,激发波长,Emission Wavelength,荧光,*,荧光检测
10、池的设计,衍生化试剂,OPA 伯胺衍生化试剂,CHO,CHO,o-phthalaldhyde (OPA),+ R-NH2,N-R,A,A,ADAM 脂肪酸衍生化试剂,CHN2,9-anthryldiazomethane (ADAM),+ R-COOH,CH2OCOR,示差折光检测器,光学系统,示差折光检测器,糖的色谱图,分析条件 柱 : Shim-pack CLC-NH2 流动相 : Acetonitrile / water = 7 / 3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 室温 Peaks1. 甘油l2. 木糖醇3. 果糖4. 葡萄糖5. 蔗糖6. 乳糖7. 乳糖,电导检测器,I,V
11、,L,A,A,K (电导率) = I A / E V=A cm2 / L cm x k(k : 特殊电导率)k= (I/E)x(L/A),电极,电导检测器,温度对电导率有很大的影响. 必须将检测池置于恒温装置中.,分析条件 柱 : Shim-pack IC-A3 流动相 : 8.0 mM p-hydroxybenzoic acid 3.2 mM Bis-Tris * 流速 : 1.5 mL/min 温度 : 40 C 进样量 : 100 uL Peaks 1. F (1.4 ppm) 2. Cl (10200 ppm) 3. NO2 (10 ppm) 4. Br (43 ppm) 5. NO3
12、 (44 ppm) 6. SO4 (431 ppm),尿液中阴离子的色谱图,Bis-Tris : bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane,电化学检测器,工作电极,辅助电极,参比电极,ECD检测器的原理, 应用 GC : 苯酚类化合物一般使用 Pt : H2O2 Ag : 卤素离子 Au : 糖分析,儿茶酚胺类物质的色谱图,分析条件 柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : 80 mM phosphate buffer (pH=2.7)100 mM NaNO3, 200 mg/l SOS5 mg/l EDTA, 4 % acetonitrile 流速 : 1.0 mL/min 使用电压 : + 0.8 V 温度 : 40 C 进样量 : 10 uL Peaks 1.去甲肾腺上素 ( 5 ppb) 2. 肾腺上素 (5 ppb) 3. 多巴胺 (5 ppb),LCMS 大气压离子化,电喷雾(ESI)大气压下化学电离(APCI),H,i,g,h,V,
