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1、猪圆环病毒2型疫苗研究进展,汇报人：赵微,目录,猪圆环病毒病是危害全球养猪业的重大经济影响性疾病，也是我国养猪业的三大疾病之一，与猪瘟和猪蓝耳病并称我国养猪业的三座大山。,PMWS,PCVAD,目前，对于猪2型圆环病毒（）造成的相关疾病尚无有效的治疗措施，而且圆环病毒对各种消毒剂都有很强的抵抗性，猪场难将其净化，预防该病的首要方案是采用疫苗进行预防接种。,PCV2 属于圆环病毒科圆环病毒属成员，是一种共价闭合、单股环状负链DNA病毒，呈二十面体对称，无囊膜。PCV2 病毒粒子直径为17nm ，基因组大小约1.7kb ，是目前发现的最小的动物病毒。PCV2 的基因组结构存在11 个开放阅读框(O
2、RFs)，即ORF1-ORF11 ，ORFs 之间大小相差悬殊，所编码的蛋白大小在236ku 。ORF1 与ORF2 是PCV2 最大的个开放阅读框，分别编码与病毒复制相关的蛋白ep和ep以及病毒的结构蛋白ap。,ap 蛋白作为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，是PCV2 的主要免疫保护性抗原，能诱导动物机体产生特异性免疫应答，是研制PCV2 基因工程亚单位疫苗的理想靶抗原。ORF3 为病毒复制的非必需基因，其编码的蛋白可诱导PCV2 感染的细胞发生凋亡。许多学者在PCV2 基因组结构与功能方面开展了大量研究，除ORF1 ,ORF2 与ORF3 的功能研究较为透彻外，其他ORFs 的功能尚
3、不十分清楚。,目前，国际上统一将PCV2 分为PCV2a、PCV2b、PCV2c 三个基因亚型，其中PCV2a 和PCV2b 是目前存在的主要基因型，PCV2a 仅分离自无PMWS感染猪场，PCV2b 多分离自PMWS发生的猪群，PCV2c亚型毒株仅在20世纪80年代于丹麦分离，在致病性方面未见报道。PCV2在世界范围内广泛分布并且在猪群中存在至少有50多年，血清学和病原学调查己证实全世界范围内许多国家和地区的猪群均存在PCV2感染，几乎100%的商品化养猪场感染过PCV2，严重影响世界养猪业的发展。,目前对该病毒的防控主要依靠疫苗，灭活疫苗、亚单位疫苗和嵌合病毒灭活疫苗已投入使用，核酸疫苗、
4、活载体疫苗和标记疫苗等新型疫苗已成为PCV2 疫苗研究的热点。,PCV2 国外流行情况,2003 2008,Olvera,PCV2a,PCV2b,Dupont 等对GenBank 中1997 年至2006 年间上传的218 个PCV2 全基因组进行遗传进化分析，结果发现2003 年前猪群中主要流行PCV2a ,之后世界范围内猪群PCV2 感染存在转型趋势，主要以PCV2b 基因型流行为主，同时PCVAD 临床表现较2003 年之前更为严重，但是这些国家不包括韩国、日本和澳大利亚。,基于以上研究，Tanja Oprissnig 等分析了1996 - 2013 年间分离自美国和加拿大的750 份样
5、品，1996 - 2004 年间分离到的毒株均属于PCV2a 基因型，2005 年出现新基因型PCV2b ,2006 - 2013 年的流行株为PCV2b 基因型。,2012年月，美国在一PCV2 免疫失败猪场首次分离到毒力均强于PCV2a 和PCV2b 的突变毒株(Mutant porcine circovirus type 2b,PCV2b），由于美国商品化疫苗基于PCV2a 基因型，PCV2b 毒株的发现让人们更加关注当前PCV2a 型疫苗的免疫效果。,北美地区在2004 年前仅流行PCV2a 基因型,2005 年爆发严重的PCVAD,PCV2b 基因型替代PCV2a 型在北美地区商业化
6、猪场迅速蔓延，引起高发病率和死亡率。随后在中国、泰国、韩国、丹麦、瑞士也相继报道了PCV2b 基因型的出现，并在一段时间内与PCV2a 基因型循环流行。,2007 年Chae 等在韩国分离到36 株PCV2(PCVAD 发病猪场分离到29 株，PCVAD 未发病猪场株)，29 株均属于PCV2b，PCVAD 未发病猪场中有4 株属于PCV2b。2006-2007 年间，日本存在PCV2a 与PCV2b 两种亚型，但是以PCV2b 为主要流行基因型。,目前，PCV2b 基因型替代PCV2a 型成为优势基因型，有关PCV2 流行毒株遗传变异的报道也逐渐增多，在遗传变异及免疫压力下可能出现其它形式的
7、突变毒株。2008 年ess等报道了PCV2a 与PCV2b 重组毒株，随后有关不同PCV2b 毒株之间以及PCV1 与PCV2a 之间毒株发生基因重组相继报道。同时进一步研究发现，重组毒有很高的体外繁殖能力，且抗原性发生改变，这些改变对致病性的影响有待进一步研究。,PCV2 基因型的漂移最早起源于欧洲，发生于2003 年或更早时间，北美洲和亚洲约发生于2005 年，大洋洲发生这种优势流行株转变约在2006 年，时间上均比欧洲PCV2 基因型的改变有轻微的推迟，潜在原因还未得到证实，可能与进口处于该病潜伏期的动物有关。基因型发生漂移的同时伴随着严重的圆环病毒病的爆发，虽然现有数据不能直接证明这
8、些爆发是由PCV2b 毒株导致，但是时间和地点上的巧合推测PCV2 主导型的变化与PCVAD 的发生存在很大关系，而基因型转变的原因与机制目前尚不清楚。相对于PCV2 遗传变异，PCV2 自然重组变异的报道比较少，其重组与病毒致病性和遗传进化的关系尚不明确。,我国PCV2 流行情况,ang等从全国分离到49 株PCV2 ，其中2001 年分离到株均属于PCV2a 型，2002-2006 年分离到34 株PCV2 中PCV2b 有18 株，2007-2008 年间分离到12 株均为PCV2b 型。Li 对2001-2009 年间分离自我国东部的136 株PCV2 进行遗传进化分析发现，PCV2b
9、 有127 株，PCV2a 仅有9 株，其中8 株PCV2a 分离自2001-2005 年间，从2005年以后，几乎所有的分离株都是PCV2b 型，PCV2a 型越来越少，中国东部地区PCV2 流行毒株存在由PCV2a 向PCV2b 漂移的现象。,王佳慧利用PCR 方法对中国16 个省市75 个规模化猪场2010-2011 年间的688 份样品进行检测，被检猪场PCV2 阳性率为58.67% ,共分离到53 株PCV2 ,与GenBank下载的192 株中国分离株进行遗传变异分析，结果发现，53 株PCV2 中PCV2b 基因型有50 株,且2001 年前我国优势PCV2 基因型为PCV2a
10、型,2002 年之后流行的PCV2 基因型转变为PCV2b 型,但同期仍有PCV2a 型毒株存在。,赵英杰对2011-2012 年间采集自我国18 个省市932 份样品分析发现，2011-2012 年我国主要养猪地区规模化猪场PCV2 的感染率高达67.8%，并选取具有代表性的74 株PCV2 进行全基因组测序，其中56 株PCV2b 基因型。同一时期，Wei 等自我国南方14 个商业化猪场分离到66 株PCV2 ，其中92.42% 的毒株属于PCV2b 基因型。流行病学调查显示，我国优势流行基因型为PCV2b 。,目前，国外有很多关于PCV2 流行毒株的变异的报道，但是我国对此研究比较少。2
11、011 年Cai 分离到了5 株PCV2a 和PCV2b 基因型间重组毒，重组位点均位于ORF2 区段内。Guo 对2004-2008 年采集自我国10 个省份疑似PCV2 感染的病料中分离到19 株PCV2 ，有4 株病毒ORF2 编码基因发生突变，同时选取了2 株突变株进行致病性实验，发现突变株所造成的病理损伤、病毒血症、淋巴组织等免疫器官损伤明显严重，新出现的突变株如何增强毒力的分子机制还需进一步研究。,PCV2在我国猪群中已经广泛存在，主要有PCV2a 和PCV2b 两种基因型，自2005 以来主要以PCV2b 基因型流行为主，同时出现mPCV2b 毒株，未发现PCV2c 基因型。,国
12、外上市疫苗有灭活疫苗、Cap亚单位疫苗和PCV1-2 嵌合病毒灭活疫苗,均基于PCV2a 基因型，虽然PCV2a 疫苗能降低猪临床PCVAD ,减少PCV2a 的流行,但是不会显著减少PCV2b 在猪群中的传播。日本研究者发现,PCV2 疫苗的免疫效果与PCV2 基因型有很大关系,流行毒株与疫苗株遗传关系越近，疫苗产生的免疫保护效力越好。为了进一步证实这一发现，Tanja Opriessniga 用PCV2a 型疫苗和PCV2b 型疫苗分别免疫猪群，PCV2进行攻毒，检测结果发现，PCV2b 型疫苗可以抵抗PCV2b、PCV2a/PCV2b 共感染提供更好的免疫保护。,国内上市疫苗属于PCV2
13、b 型灭活疫苗，虽然与流行毒株属于同一基因型，但是传统灭活疫苗抗原制备上病毒滴度低，生产周期长，且诱导的免疫应答主要为体液免疫，忽视了细胞免疫应答在PCV2 免疫保护中的作用。虽然商品化疫苗的应用为有效防控PCV2 感染发挥了重要作用，但是疫苗株与流行株分属不同基因型，且传统疫苗在免疫保护效力和生产制备上存在缺陷。随着基因工程技术的发展，基于PCV2b 型的活载体疫苗、核酸疫苗及标记疫苗等新型疫苗也展现出良好的研究前景。,PCV2灭活疫苗,PCV2 灭活疫苗是将PCV2 感染的细胞培养物通过理化方法处理，使其丧失感染性但仍保持良好的免疫原性，然后加入佐剂乳化制备而成。该类疫苗具有使用安全，易于
14、保存，性能稳定等优点。,国外学者较早投入PCV2 灭活疫苗的研究工作中，法国梅里亚公司于2006年成功研制出通过欧盟认证的首例PCV2 全病毒灭活疫苗Circovac。Opriessnig 等研究发现，用Circovac免疫妊娠母猪和仔猪均能降低仔猪PCV2 病毒血症和各组织器官中病毒载量，促进新生仔猪的生长，其原因可能是由于在给妊娠母猪注射疫苗后，诱导机体产生了抗PCV2 的特异性抗体，仔猪通过吮吸初乳获得了抵抗PCV2 感染的被动免疫力。,Kurmann用该疫苗免疫PCV2 亚临床感染的母猪，共分次免疫，首免和二免分别在妊娠前周和周进行，三免在妊娠期第12 周进行，结果发现免疫母猪的血清抗
15、体水平比未免疫母猪的血清抗体水平提高了倍，新生仔猪的血清抗体水平也随之增加，并能提高仔猪平均日增重率，缩短仔猪育肥期。由此可见，Circovac具备优良的免疫效果，能使免疫母猪和免疫仔猪获得稳定的群体免疫力，保护其免受PCV2 感染。,在国内，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘长明研究员成功地研制出中国首例PCV2 灭活疫苗(LG株)，该疫苗具有抗原含量高、免疫原性强、安全性好、抗母源抗体干扰及免疫效果好等特点，临床试验结果表明，疫苗接种猪群与空白对照组对比，主动免疫仔猪发病率下降15.1%，死淘率下降3.6%；被动免疫母猪结果显示，出生时死胎率下降2.3%，初生仔猪成活率提高7.6%，断奶时成
16、活率提高7.5%。该疫苗的使用对我国PCV2 流行有效地进行防控，给养猪业带来巨大的经济效益。此外，南京农业大学姜平教授研制的PCV2 灭活疫苗（SH株）也已注册上市，目前正在全国大部分地区推广使用，展现出广阔的应用前景。这种疫苗的成功研制和应用对防控我国PCV2 感染发挥了重大作用。,PCV2弱毒疫苗,弱毒疫苗又称为减毒活疫苗，是将病原体的致病力通过自然筛选或人工致弱等方式减弱制备而成。尽管该类疫苗的毒力已经致弱，但仍然保持着原有的免疫原性，并能在动物体内繁殖，刺激动物机体免疫系统，从而诱导产生坚实的免疫力和持久的保护力。,国内外对PCV2 弱毒疫苗研究的报道较少，目前还没有商品化的PCV2
17、 弱毒疫苗，主要原因与病毒毒力易返强、致弱毒株毒力评价困难等因素有关。Fenaux等将PCV2 分离株在PK15 细胞上连续传代培养，结果发现第120 代病毒(VP120)滴度约为第代病毒(VP1)滴度的10 倍，VP120 感染的仔猪出现病毒血症的发生率明显低于VP1 感染的仔猪，并且感染仔猪的血清中PCV2 DNA拷贝数更低，眼观和病理组织学变化也更轻，表明体外传代可促进PCV2 在细胞内的繁殖能力，并能减弱其致病力，这为研制PCV2 弱毒疫苗提供了科学依据。由于单一PCV2 感染对猪的致病性并不十分典型，病毒在体内持续存在，其毒力是否返强等关键问题没有阐明，试验数据有限，这种方法得到的毒力减弱毒株作为疫苗离应用还有很长的路要走。,
