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1、第四讲 基因工程动物细胞培养制药工艺药用蛋白质的合成复杂，要有精确折叠的空间结构，要有糖基化，才能使药物发挥真正的功能。细菌和酵母等产品要么是包涵体，要么难以糖基化功能修饰。动物细胞的培养技术来生产有功能的蛋白质，大规模动物细胞特别是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要。 人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰质炎、乙肝疫苗。 干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。 组织型血纤蛋白溶酶原激活剂、免疫珠蛋白G、M、尿激酶、人生长因子等。,第一节 动物细胞制药的表达系统与特征昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。 一、哺乳
2、动物细胞表达系统与特征 1. 动物细胞的特征 细胞膜、细胞质 和细胞核 没有细胞壁。 亚细胞器，功能独特。,2. 动物细胞代谢动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定的亚细胞区域。通过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间的物质、信息和能量流动，通过穿梭实现不同代谢途径之间的交换。 在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合成代谢的前体，因此动物细胞的培养具有一定的灵活性。 葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以补偿，反之亦然。谷氨酰胺是动物细胞的氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其他氨基酸的消耗得以补偿。,糖代谢特点： 动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，进一步被还原
3、为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。 丙酮酸还可转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，彻底氧化产生CO2和水。小部分（48）葡萄糖进入戊糖磷酸途径，把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力NADPH，5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。 葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。,氨基酸代谢特点： 吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。 大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。 谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物-酮
4、戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用是主要的代谢途径。,不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸来源于谷氨酰胺。 在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以ATP和NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。 常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒废物积累。,3. 蛋白质糖基化 蛋白质合成是以mRNA为模
5、板，在核糖体上完成。而蛋白质的糖基化无需模板指导，因此糖蛋白的寡糖结构容易发生变化。 糖蛋白的单糖单元:-D-葡萄糖、-D-半乳糖、-D-甘露糖、-D-木糖、-D-岩藻糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺和-N-乙酰神经氨酸（或唾液酸）。 糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为N-糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化的位点和数量及糖的种类都不同。,N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上，其模体的保守序列为Asn-X-Thr/Ser (X为除脯氨酸以外的任意氨基酸)。如果X为Trp、Asp、Glu和Leu，对糖基化有负影响，而第三位Thr能增强糖基化。
6、N-糖基化分为高甘露糖型、复合型和杂合型三种类型，共同核心是3个甘露糖和2个N-乙酰葡萄糖胺组成的5糖（Man3GluNAc2），其他糖形成支链。 高甘露糖型的支链为甘露聚糖（59聚体），无其他糖。 复合型含有2个以上支链，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。 杂合型至少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。,O-聚糖连接在Thr/Ser的羟基上，还没有发现保守序列。 O-聚糖有四种不同的核心结构，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化会影响蛋白质的局部构象。 O-糖基化比较小，一般为16个寡聚糖，但比N-糖基化变化更大。 O-糖基化只在高尔基体上进行，糖基单元有木糖、葡萄糖。,糖基化磷脂酰肌醇锚着点：
7、它在膜与蛋白质之间形成稳定的相互作用，都具有相同的核心结构：胆胺-PO4-Man2-GlcHN2-肌醇-PO4-脂。 胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。 在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割此类蛋白，有利于纯化。,细胞特异性糖基化途径淋巴细胞中进行，它不依赖于内质网和高尔基体。 IgG的糖基化，等分GlcNAc残基连接在核心甘露糖上，该糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用。 IgG蛋白的铰链区，富含Ser、Thr和Pro，5个Ser全部糖基化。 促黄体激素、促甲状腺素等的硫酸化只能在垂体中发生。,尽管哺乳动物细胞具有细胞内的糖基化装置，但不同细胞系，糖基化特征不同。 鼠和猪细
8、胞倾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠杂交瘤或人鼠杂交瘤生产的抗体中，乙酰果糖占优势。 CHO细胞不能合成等分N-乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。 要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。,2. 哺乳动物细胞表达系统 基因工程哺乳动物细胞系：失去分化能力的无限生长细胞系，即永久性细胞。表达的蛋白质能正确加工、修饰并折叠形成具有生物活性的功能分子，接近或类似天然产物。 糖基化等修饰是糖蛋白行使功能所必需的，而且对产品质量有影响，如生物活性、稳定性、免疫原性等。原核细胞表达的EPO无糖基化，在体内表现无活性。原核表达的GMCSF虽有活性，但在体内产生抗体。 动物细胞表
9、达产物分泌到培养液，容易分离纯化。约有70批准的蛋白质药物由哺乳动物细胞系统表达制造，而且数目还在不断增加。,动物细胞表达系统的不足是细胞生长缓慢，生产效率较低，产量远远落后于其他表达系统。 骨髓细胞MPG11生产IgG的能力为5pg/(细胞.分钟)，10L反应器，密度为107/ml，生产能力不到1g/d。 连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时导致了副产物的增加。 动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对温度、pH、渗透压、剪切力等忍受能力差。培养基要求高，需要添加氨基酸、维生素等，往往需要附加血清，提供生长因子，费用较高。同时可能有潜在的致病因子、免疫原性存在。 表达载体的改进和宿主细胞的改造
10、是动物细胞表达系统的研发重要内容。,3. 昆虫细胞表达系统与特征 表达载体为昆虫病毒，转染昆虫细胞，表达出目标蛋白质。昆虫病毒主要有杆状病毒科核多角体病毒。 苜蓿尺蠖核多角体病毒秋黏虫细胞表达系统，家蚕核多角体病毒家蚕幼虫表达系统。 MicroGene Sys公司表达艾滋病基因工程疫苗，随后猪生长素、CD4膜蛋白及疟疾疫苗、鸡新城病毒疫苗、血吸虫GST疫苗、乙肝表面抗原、重组人GMCSF等。日本批准用家蚕系统生产干扰素已上市。生物试剂盒的标准品大多用昆虫表达系统生产。 至少有600多种昆虫可以作为宿主，每年有数百个基因利用昆虫系统进行表达，越来越成为非常有用的表达宿主。,优点 1）安全：杆状病
11、毒无致病性，产品安全性受FDA认可。 2）易饲养：家蚕丧失了野外生存能力，饲养，发育快， 3）高量表达：用强启动子，外源基因可超量表达。表达产物在昆虫细胞内能结晶，对产物纯化非常有意义。 4）高效表达：可容纳较大的外源基因（12kb），表达数个外源基因，并且正确装配成有功能的分子。如表达抗体的重链和轻链，自主装配成有功能的抗体。 5）翻译后的加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后的加工，包括糖基化、脂肪酸酰基化、磷酸化、氨基酸的乙酰化、氨酰化等，大部分产物显示出良好的活性。,缺点： 1）重组率低，筛选困难，周期长，需要410天。 2）外源基因的表达在转染的晚期，大约在20h后起始基因表达，在7294
12、h细胞裂解死亡，基因表达时间约3050h，高水平表达不连续且时间短，这对表达不利。 3）昆虫细胞糖基化等加工途径与哺乳动物细胞不完全相同，它不提供复杂的N糖基化，如添加半乳糖和唾液酸残基，有可能造成溶解性、稳定性、免疫性等变化。表达水平非常高，加工装备跟不上，蛋白质修饰效率可能不高。 研究开发的主要方向：有效的病毒表达载体； 决定基因表达时期启动子，无血清培养昆虫细胞系。,第二节 基因工程动物细胞系的构建 构建高效表达载体 转染动物细胞 筛选鉴定 获得生产用工程化细胞系,动物细胞的表达载体：病毒载体，质粒载体。 病毒载体： 逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原始病毒改造而来。 同
13、源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表达时间较长。 痘病毒载体可插入2540 kb外源基因，甚至是多个基因。无感染性和致癌性，可用于构建基因工程疫苗。 美国Genentech公司已用SV40载体生产乙肝疫苗，其他载体可用于基因治疗。,质粒载体： 微生物的质粒载体类似，一般是穿梭质粒，具有两个复制子和抗性筛选标记基因。 大肠杆菌的复制子，细菌中繁殖。 抗生素抗性标记，原核细胞筛选。 动物细胞的复制子， 在宿主细胞中稳定表达。 还有丝状噬菌体复制子。,启动子序列：含有RNA聚合酶识别和结合位点，以便有效转录。TATA盒，确定起始位置；GG盒，影响转录频率。 来源于病毒、动物基因和噬菌体的启动子
14、。 动物病毒启动子：逆转录病毒的长末端重复序列（LTRS）、SV40病毒的早期和晚期启动子、腺病毒的晚期启动子、人巨噬病毒（CMV）立即早期基因启动子。 动物基因的启动子：转录因子EF-1启动子、泛素蛋白启动子、-肌动蛋白启动子、干扰素-启动子、IgG启动子、鼠金属硫蛋白基因启动子等。 噬菌体T7启动子比动物基因启动子表达水平高。,PolyA信号序列：保持mRNA的稳定性，防止降解，保证了转录产物的加工和正确性，但序列不宜太长，避免能量过度消耗。添加PolyA信号和5端转录暂停位点，可以减少上游序列转录通读造成的背景。 牛生长素（BGH）基因的PolyA信号比SV40 PolyA更强，常用于高
15、效表达载体中。 终止序列：AAUAAA或连续的终止密码UGA、UAA和UAG，能防止转录通读，使转录在正确的位点结束。 在转录起始点上游或下游使用相同类型的增强子，有利于提高外源基因的转录水平。,双顺反子表达载体： 两个基因在同一启动子控制之下，内部核糖体进入位点使同一mRNA中的第二个基因得到翻译。将dhfr与目标基因串连，dhfr的cDNA插入内含子中，其转录产物被剪切，翻译不出蛋白质，而目标基因的转录产物得到翻译。 顺反子在多亚基蛋白的偶联表达及其控制策略等方面有广泛应用前景。 使筛选容易，而且能高效表达。,选择适宜的启动子，可实现定向表达。 CMV启动子和人EF-1启动子，可实现同一载
16、体上的二个基因的独立表达。 组织特异性启动子：如鼠、山羊酪蛋白启动子，可使基因主要在乳腺中表达。 N端设计分泌信号肽：如Ig 链的可变区和恒定区之间序列，使外源基因的表达产物向胞外分泌。 C端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面。 亚细胞定位信号肽：目标基因产物将转运到细胞核、线粒体、内质网或细胞质中，这对基因的功能研究非常合适。,基因的扩增系统： 在逐渐提高选择压的情况下，使选择标记基因拷贝数增加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提高表达基因水平。 最常用二氢叶酸二氢叶酸还原酶（DHFR）基因系统和谷氨酰氨合成酶（GS）基因系统。 氨甲喋呤基因与目标基因重组，氨甲喋呤使dhfr基因与目标基因大量增加，达到数千拷贝。 硫胺蛋氨酸使GS系统的基因得到大量扩增。,二、受体细胞 1人源细胞株系 Namalwa：类淋巴母细胞，非整体核型。表达IgM，悬浮生长。外源基因的表达水平较高，可用无血清培养基高密度培养，已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等。英国Wellcome公司用Namalwa细胞的反应器达8000L，用Sendai病毒诱导，大规模生产干扰素，并批准上市。 WI-38：二倍体成纤维细胞系，2n=46，第一个被用于制备疫苗。贴壁生长，对很多病毒敏感，广泛用于疫苗生产。 MRC-5：二倍体成纤维细胞系，但生长较WI-38快，对逆境有一定抗性也用于制备疫苗。,
