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1、 葡萄籽提取物对缺血再灌注导致衰老大鼠 肾小管上皮细胞凋亡的保护 作者：洪权 肖博晗 魏日胞 汪杨 刘晓峦 冯哲 陈香美【摘要】 目的 探讨葡萄籽提取物（Grape seed extract proanthocyanidin，GSPE）对缺血再灌注（I/R）导致衰老大鼠肾小 管上皮细胞凋亡的保护作用。方法 分离培养 24 月龄 DA）含量和 超氧化物歧化酶（SOD）活性。激光共聚焦检测细胞内活性氧(ROS) 的浓度。结果 （1）衰老大鼠肾小管细胞经 Antimycin A 处理后， 凋亡率增高，Caspase3，MDA，ROS 明显增加，SOD 下降； （2）经 GSPE 干预后，其凋亡情况明
2、显好转， caspase3、MDA、ROS 明显降低。SOD 含量部分恢复（P0.05）。 结论 老年大鼠肾小管细胞在 I/R 损伤时，ROS 堆积，线粒体损伤 导致肾小管上皮细胞凋亡。GSPE 可清除 ROS 从而达到抑制肾小管 上皮细胞凋亡、减轻 I/R 损伤的作用。 【关键词】 衰老；活性氧；肾小管上皮细胞；缺血/再灌注损伤； 凋亡【Abstract】 Objective To explore the protective effects of Grape seed extract proanthocyanidin(GSPE）to the renal tubular epithelial
3、 cells of aging rats induced by ischemia and reperfusion. Methods The 24 month DA and ROS ulation of ROS and the damage of mitochondria lead to the apoptosis of renal tubular epithelial cell. GSPE can remove ROS and prevent the apoptosis of kidney tubular epithelial cells, lessen the impaired effect
4、s of I/R. 【Key ia/reperfusion; Apoptosis急性肾脏缺血再灌注(I/R)损伤是休克、严重创伤及肾移植过 程中一种常见的临床病理生理现象，可以导致急性肾衰竭（ARF） 和移植肾功能丧失，在这一过程中最先受到损伤的细胞是肾小管上 皮细胞，老年人由于容易出现肾脏低灌注状态，如心肌梗死、脱水、 利尿剂的使用以及老年人常见的肾动脉硬化因此更容易出现 ARF。 近年来 ARF 中活性氧（reactive oxygen species ，ROS）激增导致的 肾小管上皮细胞凋亡引起了人们的关注1。很多的证据显示 ROS 能增加线粒体通透性转变孔道（PTP）的通透性，导致细胞
5、色 素 C 释放，引起凋亡。既往研究认为葡萄籽提取物(GSPE)具有抗氧 化功能，可减少动脉硬化，能影响内皮细胞的凋亡增殖过程。本研 究模拟并观察老年大鼠肾小管上皮细胞在缺血再灌注（I/R）损伤情 况下，ROS 在肾小管上皮细胞凋亡中起到的作用。使用抗氧化剂葡 萄籽提取物（GSPE）给与实验性治疗，观察 GSPE 抑制 ROS 产生 后，是否对肾小管上皮细胞有保护作用及对老年高 ROS 负荷状态的治疗效果。1 材料与方法1.1 实验动物与器材 雄性 EM 培养基、Trizol 试剂、 MMLV 反转录试剂盒（美国 Invitrogen 公司），Antimycin A（抗 霉素 A，AA），An
6、nexin V/PI 凋亡检测试剂盒（美国 Biodesign 公 司），兔来源抗 caspase3 多克隆抗体（美国 Santa Cruze 公司）， CaspACETM Assay System（ Promega 公司）、Icycler PCR 仪、 radiance 2000 激光共聚焦显微镜（美国 Biorad 公司）。1.2 方法1.2.1 细胞培养 常规方法分离大鼠肾小管上皮细胞，用含 10胎牛血清(FBS)的 DMEM 培养液，常规条件下培养。细胞以适 当密度转种，实验前换用含 0.5% FBS 的 DMEM 培养液继续培养。1.2.2 实验分组 肾小管上皮细胞加入 5.0 mo
7、l/L GSPE 和/或 10 mol/L antimycin A 的 10% FBS DMEM 孵育 2 h，37预温的 PBS 清洗之后换成正常的培养液，以模拟细胞缺血再灌注损伤状态。 实验分为正常对照组，Antimycin A 组，GSPE 组和 Antimycin A+GSPE 组。1.2.3 细胞凋亡检测分析 AnexinV/PI 染色：胰酶消化细胞， PBS 清洗 2 次，加入适量的荧光标记的 annexin V 试剂和 PI，混匀 后避光室温下孵育 15 min，孵育后加入 400 l 染色缓冲液，立即上 流式细胞仪分析并记录结果。1.2.4 激光共聚焦检测细胞内 ROS 含量
8、直径 3 mm 激光共聚 焦专用培养皿中肾小管上皮细胞经 GSPE 和/或 AA 处理后，加入 10 mol/L CMH2DCFDA 37孵育 15 min，随后 PBS 清洗 2 次，于 激光共聚焦显微镜下检测观察，激发波长选用 485 nm，发射波长选 用 530 nm。利用 LaserPix Image softe PCR 检测 caspase3 mRNA 表达 Trizol 提取各组细胞总 RNA，逆转录为 cDNA。设计合成大鼠 capase3 引物，上游：5AATTCAAGGGACGGGTCATG3， 下游：5GCTTGTGCGCGTACAGTTTC3，Taqman 探针： 5FA
9、MTTCATCCAGTCACTTTGCGCCATGTAMRA3，产 物长度：96 bp。25 l PCR 体系中含： 1.0 l cDNA,5.0 l 25 mmol/L MgCl2,1 l dNTP Mix，0.25 l DNA 引物，2.5 l 10PCR buffer，1.5 U Taq DNA 聚合酶，PCR 扩增反应条件为：94/30 s，56/30 s，72/30 s，共 40 个循环。以大鼠 GAPDH 为参照， 上游:5GGCATGGACTGTGGTCATGAG3；下游： 5TGCACCACCAACTGCTTAGC3，Taqman 探针： 5FAMCCTGGCCAAGGTCAT
10、CCATGACAACTTTAMRA3, 产物 87 bp ，PCR 体系同上，条件为：94/30 s，60/30 s，72/30 s，共 40 个循环，数据采集及分析软件为 icycler3.02。1.2.7 mol/L TrisHCl pH7.5、150 mmol/L NaCl、0.5%脱氧胆 酸、1%Nonidet P40、0.1%SDS）提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒检 测蛋白浓度后以 80 g 上样行 10% SDSPAGE 电泳，100 V 2 h， 常规条件转膜至 PVDF 膜，丽春红染色，5% BSA/TBST 4封闭过 夜后加 1100 稀释的兔来源抗 caspase3 多抗室
11、温孵育 4 h，TBST 漂洗 3 次后加 11 000 稀释的 FITC羊抗兔二抗室温孵育 1 h，TBST 漂洗 3 次后 ECL 化学发光显影。以 actin 作为内参校 正上样量，同样的方法进行杂交。利用 AlphImage2200 对结果进行 扫描分析灰度。1.2.8 caspase3 活性测定 比色法测定 caspase3 活性，按试 剂盒说明书操作。酶标仪测定 405 nm 吸光度。建立标准曲线，计算 caspase3 活性。1.3 统计学处理 计量资料采用 xs 表示。不同组间比较用单 因素方差分析，同一干预因素的比较用 t 检验。采用 SPSS11.0 统计 软件进行统计学处
12、理。2 结果2.1 细胞凋亡检测 流式细胞仪检测结果显示，AA 处理后， 肾小管上皮细胞出现了凋亡，其凋亡率（23.4%3.3%）明显高于正 常组（0.9%0.4%）（P0.05）。经 GSPE 处理的细胞，其凋亡情 况明显好转（12.8%2.1%），与 AA 处理组相比具有统计学意义 (P0.05），但仍然高于正常组。2.2 细胞内 ROS 含量 激光共聚焦显微镜检测显示，细胞经 10 mol/L 的 AA 处理后，ROS 明显升高（73.72.30），与正常组 （48.314.9）相比有统计学意义（P0.05），而 GSPE 组 ROS 含 量接近正常组，经 GSPE 干预后再行 AA 处
13、理，ROS 的升高不明显 （52.016.1），比单独 AA 处理组的 ROS 明显降低（P0.05）， 但仍然高于正常对照组（图 1）。图 1 激光共聚焦检测细胞内 ROS 的生成（略）2.3 细胞内 MDA、SOD 含量 与正常组相比，细胞经 AA 处 理后，MDA 含量明显增加，SOD 活性显著降低（P0.05）。GSPE 处理后，与单独 AA 组相比，MDA 降低，而 SOD 也明显恢复 （P0.05）（图 2）。2.4 caspase3 mRNA、蛋白表达水平及活性水平 与正常组 相比，细胞经 AA 处理后的 capase3 mRNA 和蛋白表达水平显著 增高、活性增强（P0.05）
14、。而 GSPE 加 AA 处理后，与单独 AA 组相比，其表达水平和活性都显著下降（P0.05）。（图 3图 5）。与 AA 组比较：1)P0.05，下图同图 2 化学发光法检测细胞内 MDA、SOD 含量（略）图 3 Real Time PCR 检测细胞内 caspase3 mRNA 表达（略）图 4 1，ICAM1 和 Eselectins 的表达，抑制血小板积 聚，以及通过增强和/或增加内皮细胞 NO 和 NOS 的表达引起的血 管舒张9。 本研究体外培养衰老大鼠的肾小管上皮细胞， 给以 Antimycin A 培养，该物质能耗竭细胞内的 ATP，从而模拟体 内缺血缺氧的状态，恢复正常培
15、养液后，相当于体内的再灌注过程， 研究结果表明细胞经 AA 处理后，凋亡率达到 23.4%3.3%，而给以 GSPE 保护后，可以部分降低细胞凋亡率（12.8%2.1%），虽然仍 高于正常，但显著低于 AA 处理组，表明 GSPE 对保护衰老大鼠肾 小管上皮细胞的凋亡损伤有一定作用。 为明确 GSPE 保护细胞 凋亡的机制，本研究根据 GSPE 既往的研究情况，选择了检测细胞 产生 ROS 的水平以及 SOD 情况，同时还检测了凋亡相关蛋白 caspase3 的 mRNA 和蛋白水平及其活性。结果表明，同时给以 GSPE+AA 处理的细胞内 SOD、ROS 和 MDA 的生成虽然未恢复到 正常
16、细胞水平，但已经显著区别于单独给以 AA 组处理的细胞组， 结果表明 GSPE 可以增加细胞清除 ROS 的能力。同样，AA 组衰老 大鼠肾小管上皮细胞的 caspase3 mRNA 水平、蛋白水平及其活性 都比正常组显著升高（P0.05），而同时给以 AA+GSPE 处理后能 降低 caspase3 活性（P0.05），因此，可以认为 AA 诱导细胞凋 亡是通过 capase3 这一经典途径，而 GSPE 能通过清除 ROS 而减 少 caspase3 的活性，从而保护细胞的凋亡进展。 综上所述， 本研究在体外模拟了衰老大鼠肾脏 I/R 损伤模型，用抗氧化物 GSPE 处理后，能减少 ROS、MDA 的生成，部分恢复 SOD 的水平，从而 缓解肾小管上皮细胞的凋亡情况，起到了一定的保护作用。研究结 果支持抗氧化剂在老年肾功能衰竭中
