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1、免疫组化在病理诊断中 的正确应用,周晓军 南京军区南京总医院,引言,免疫组化技术已广泛应用于病理诊断： 在解决疑难病例诊断方面起着重要作用； 随着人们医疗风险意识的增强，许多普通的病例也常常需要免疫组化进一步证实； 成为病理医生常规工作不可缺少的重要工作；常规手段； 每年12000篇新的文献（2005年, 人体病理）,引言,肿瘤病理诊断： HE形态 HE形态 + 特染，电镜 HE形态 + 免疫组化 + 分子病理？ 免疫组化： 新的误诊？ 更客观！ 新的诊断标准！更权威！ 成功的病理医生 临床知识 + HE形态知识 + 免疫组化知识,引言,免疫组化技术广泛应用于病理诊断工作得益于免疫组化技术的进
2、步： 抗原修复技术； 更加敏感的检测系统或放大系统的建立； 更多可用于常规标本的抗体的出现； 自动免疫染色系统等。,引言,免疫组化在病理诊断应用中存在的一些问题也逐渐有所认识。如何正确应用免疫组化技术，避免由于错误地操作及判断而导致的误诊。,一、免疫组化的应用范围,免疫组化染色意味着试剂及人力等方面的支出； 但如果正确掌握适用范围，选择合适的抗体，可以及时地明确或避免误诊，或对临床分期进行更为准确的评估，有助于选择更有效的治疗方法，因此总体上节省医疗费用。,一、免疫组化的应用范围,肿瘤的病理诊断： 帮助良恶性病变鉴别； 未分化恶性肿瘤（癌或肉瘤）性质的判断； 各种圆细胞、梭形细胞、多形性肿瘤的
3、鉴别诊断； 帮助确定转移性肿瘤的原发部位等。,T G,TTF-1,CK20,CK7,肺结肠癌转移,细胞角蛋白在癌中的表达,CK7+ CK7 - CK20+ 女性生殖道黏液癌， 消化道癌 （结肠） 部分胃癌，部分胰胆道癌 Merkel细胞癌 CK20- 消化道以外的腺癌：肺、 肝癌、肾细胞癌、前列乳腺、浆液性及宫内膜癌 ， 腺癌、鳞状细胞癌间皮瘤、膀胱、宫颈、胰腺 内分泌癌（除甲状腺）唾腺来源的癌(90%),透明细胞癌的免疫组化鉴别,一、免疫组化的应用范围,淋巴造血系统疾病的诊断： 鉴别反应性增生性疾病与淋巴瘤； 各类淋巴瘤分型的重要依据。 在淋巴造血疾病的病理诊断中免疫组化目前几乎已成为常规开
4、展的工作项目。,一、免疫组化的应用范围,内分泌肿瘤的诊断：不仅可以帮助确定诊断，还可以通过检测肿瘤分泌激素达到功能分类的目的。 在软组织肿瘤、神经系统肿瘤等其他各系统肿瘤的病理诊断中免疫组化也具有重要的作用。,一、免疫组化的应用范围,小活检病理检查：能明确地显示癌细胞的存在（如胃粘膜活检中的印戒细胞癌）；肿瘤穿刺活检时肿瘤类型的确定。 微小癌、微小转移灶（淋巴结及骨髓）、甚至不易察觉的病变得以确诊。,活检,手术,类癌,SCC,类癌活检,手术,CK类癌,SCC,CgA类癌,SCC,SCC,SCC,TTF-1类癌,Ki67类癌,活检标本类癌和小细胞癌的相对鉴别,一、免疫组化的应用范围,细针穿刺、细
5、胞学诊断主要是定性诊断？ 免疫组化的应用有可能对部分肿瘤进一步地进行分类或明确来源。,一、免疫组化的应用范围,乳腺癌激素受体（ER、PR）的检测在指导临床治疗方面已起到了重要的作用。 针对肿瘤基因产物（C-erbB2, P53, ALK，CD117等）的抗体为基因治疗提供重要的参考依据。 细胞增殖核抗原（Ki-67）等免疫组化染色可为肿瘤的预后提供依据。,已用于临床的新型靶向治疗药物,美罗华：CD20单克隆抗体，用于治疗CD20+的B细胞淋巴瘤 Herceptin：c-erbB-2（neu）单克隆抗体，用于治疗c-erbB-2过度表达的乳腺癌 STI-571（Gleevec，imatinib）
6、：小分子选择性蛋白酪氨酸激酶抑制剂，用于CML和GIST治疗,一、免疫组化的应用范围,某些感染性疾病的病因诊断，如HBV、HCV、EBV、CMV等病毒的检测。 但与分子生物学等技术相比，免疫组化检测病原微生物敏感性常常较差，因此应用范围有限。,HBsAg,二、免疫组化的局限性,对于许多非肿瘤性疾病由于常常无特异的抗原表达，因此其诊断仍依据于特异的常规光镜及电镜形态表现，如肾小球肾炎的诊断，多种感染性疾病、各种代谢性疾病，细胞内/外异常物质沉积性疾病（如淀粉样变性），肌活检诊断等；,HIV,冠状病毒,分枝杆菌,组织胞浆菌,二、免疫组化的局限性,至今无绝对特异的抗体！ 相当多的肿瘤缺乏特异的抗原表
7、达； 同一种抗原常常可在多种肿瘤中表达， 不少肿瘤又由于分化太差或细胞分子结构改变而不表达相关的抗原。,二、免疫组化的局限性,不同抗体滴度有不同的阳性结果： HBME-1 1:100 (推荐浓度)间皮膜阳性，几乎所有腺癌胞浆阳性 1:200015000 仅仅间皮膜阳性 内源性生物素：假阳性（胞浆），如肝细胞及肝细胞癌,二、免疫组化的局限性,免疫组化的标准化（同一实验室及不同实验室间结果的一致性）、定量结果的判断等还存在不少的问题尚待解决。,三、如何正确应用免疫组化,正确、有价值的免疫组化结果： 免疫组化实验室规范、合适的技术操作（包括组织固定、抗原修复、检测系统、各类试剂的质量保证，染色技术等
8、）是最重要的基础保证； 但病理医生在组织块的选择，抗体的选择，结果的判断等方面也起着不容忽视的作用。,三、如何正确应用免疫组化,1、组织块的选择 首选有典型病变、分化较好、固定较好的组织块。 应尽量选择有正常组织（有内对照组织）的蜡块。 对固定时间较长或未及时固定的组织，冻融后的组织或脱钙后的组织应尽可能地避免使用。,2. 抗体的选择,经验性、知识性要求很高的一项艺术工作。 选择到组织合适的抗体费用最小而又能完全达到目的。 病理医生须通过认真观察HE切片并联系临床相关信息，准确地列出要鉴别的几种可能性诊断。 病理医生对HE形态要熟练掌握，知识面广，既不能撒大网似的罗列出太多的诊断，使费用增加过
9、多；也不能遣漏可能的诊断，造成误诊或再选择抗体延迟报告时间。,CD30,2. 抗体的选择,另一方面病理医生要对各种抗体的免疫反应谱（包括交叉反应）都十分熟悉： 如CK不仅表达于上皮还可表达于肌纤维母细胞，平滑肌细胞及间皮下细胞等。 并熟知各种肿瘤的免疫表型（包括异常的免疫组化表达）。,2. 抗体的选择,如何了解各种抗体的免疫反应谱及各种肿瘤的免疫表型？ 产品目录 ？ 专业书籍 ？ 新的文献 专家咨询 网上检索 ,2. 抗体的选择,至今无绝对特异的抗体！ 无100%病例或肿瘤细胞阳性的抗体！ 选择一组抗体而不是一个抗体 “交叉阳性”的原则：如癌与恶性黑色素瘤鉴别： 选一个或二个低分化癌表达阳性而
10、恶黑阴性的抗体，如CK、EMA， 同时还要选一个或二个恶黑表达阳性而癌表达阴性的抗体，如S100，Melan-A。 若染色结果与预期结果矛盾则应考虑其他的诊断或核查免疫组化染色是否有问题。,2. 抗体的选择,抗体选择不仅要选准，还要选足。 一个可能的诊断要选2个或多个抗体，以防肿瘤异常免疫表达造成误诊。如淋巴瘤分类诊断时，一组抗体中至少要包括2个以上的T细胞及B细胞标志（CD3、CD43、CD20、CD79a等）。,2. 抗体的选择,先采用一线抗体，先确定一定的范围，再应用二线抗体进一步明确诊断？ 可能由于一线抗体选择太少，部分肿瘤有交叉反应而导致开始就犯导向性的错误，最终导致误诊。,Kapp
11、a 轻链,Pre-pre B cell,Pre-B cell,Immature B cell,Mature B cell,Activated B cell,Plasma cell,Precursor cells; antigen independent,Virgin B cells; antigen independent,Germinal center antigen dependent,TdT,CD20, CD22,CD19,CD79a,CD10,Bcl-6,CD138,Cytoplasmic CD22,2. 抗体的选择,选择同一类抗体时还要考虑到各种抗体的敏感性及特异性。 首选当然要选敏
12、感性及特异性都好的抗体，但有些特异性虽然不高但有很高敏感性的抗体在不少情况下可能发挥更重要的作用。如S100。 不同公司生产的同一类抗体可能敏感性及特异性有所不同，或要求的抗原修复方法等技术条件不同，应根据本实验室预试验结果进行选择。,3. 结果的判断,免疫组化染色最终是否能得到正确的结论，关键还要看对染色结果如何评价（解释）。同一种染色结果可有不同的病理诊断。 应该首先核查一下染色反应是否成功（这也是免疫组化室内质控的一个重要步骤）。 评价染色反应是否成功最好比较同一张切片中存在的正常组织，即所谓的内阳性对照。,CD20,SMA,3. 结果的判断,有不少染色或病例缺乏内阳性对照，若对染色反应
13、有疑问只能选用另外的阳性对照片核实。 若内（或外）阳性对照组织免疫反应阴性，瘤组织阳性则表明假阳性；瘤组织阴性则表明假阴性。 只有阳性对照染色阳性瘤组织反应才属真实。,3.结果的判断,除了内阳性对照，还要看内阴性对照是否有非特异反应。 内源性生物素造成的非特异染色（如在肝、肾及富含线粒体的细胞等），常常表现为非特异的胞浆阳性。 总之，只有阳性对照染色阳性，阴性对照组织又基本阴性，这样的免疫组化染色结果才可信。,3. 结果的判断,其次，要分析阳性染色的部位（细胞的微解剖部位）是否正确: 如许多淋巴细胞的标志（CD20，CD43，CD5，CD45RB，CD30，C-erbB2等）应为膜阳性，若胞浆
14、弥漫阳性间或细胞核阳性则为假阳性。 反之，有的抗体染色应为核阳性（如ER，PR，TdT，Cyclin D1等），若胞浆或胞膜阳性也为假阳性。 还有的抗体可表现为二种阳性反应类型，如S100，ALK可为核阳性也可伴有胞浆阳性；CD30，CD15即可表现为细胞膜阳性，也可表现为核旁高尔基区阳性。,CD20,ER,TTF-1,Mel-pan,ALK-1,ALK-1,CEA,CEA,3. 结果的判断,随着对免疫反应靶分子部位的更深入了解，免疫反应的形态也是重要的参考依据， 如嗜铬蛋白A，细胞毒标志（粒酶B，穿孔素，TIA1）等阳性反应在胞浆内应呈颗粒状， 而CD79a等为胞浆弥漫阳性， 细胞角蛋白染色
15、阳性应为胞浆细丝状， 若反应类型不符可能也要怀疑为假阳性。 但要精确观察到阳性反应的细微类型表现必须切片薄，并采用高分辨率的显色系统。,3. 结果的判断,再者，确定免疫反应阳性的组织或细胞是否为肿瘤或有意义的组织/细胞。 若肿瘤成份较少，弥散存在，可能会将周围反应性成份或残余组织的阳性反应误认为肿瘤阳性，导致错误的诊断。 如伴有大量淋巴细胞浸润的未分化癌（鼻咽未分化癌），富于T细胞的大B细胞淋巴瘤，瘤组织中残余的横纹肌，脂肪组织等。 还有的细胞（如肥大细胞）可对多种抗体表达阳性反应，应注意区别。,3. 结果的判断,免疫组化染色阳性结果较阴性结果更有意义， 阴性结果：可能抗原的确不存在， 或抗原
16、含量低，组织处理时抗原丢失，染色方法不敏感或操作有误。,3. 结果的判断,应用于鉴别诊断或证实诊断的免疫组化染色多为定性观察，定量没有太大的意义。 但用于预后，增殖指数、激素受体等检测的免疫组化染色不仅要做定性观察，还应该做定量的评价才对临床有价值。,CK,滑膜肉瘤,3. 结果的判断,遗憾的是目前由于实验室间未实现标准化，因此定量的标准（域值）尚无统一的认识， 如ER受体，有的实验室只要有阳性肿瘤细胞就视为阳性，而有的实验室要至少20细胞阳性才视为阳性， 阳性标准往往是随意确定的，未经临床病理研究证实。,3. 结果的判断,单单免疫组化染色结果无任何诊断价值！ 免疫组化诊断时结合HE形态十分重要：抗体的选择及结果的判断都要以HE形态为依据。免疫组化诊断的一个重要原则！ 当免疫组化最后结果出乎意料之外，与HE预期结果差别很大时首先要核查免疫组化染色中存在的问题； 若确实免疫组化染色无误，要进一步核实（查阅文献/上网, 专家，产品目录？）是否有不了解的交叉反应或异常表达。,
