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1、 宁夏回、汉族人群 5，10 【摘要】 目的 研究 宁夏地区回、汉族人群及不同性别 5，10-亚 甲基四氢叶酸还原酶(methy lenetetrahy drofolate reductase，MTHFR) C677T 多态性的分布特点。 方法 应用 限制性片段长度多态性扩 增技术(PCR-RFLP)及 DNA 测序法 分析 宁夏地区 146 例回族和 169 例汉族人群及回汉族男、女性 MTHFR C677T 基因型的分布频 率。结果 宁夏汉族人群 MTHFR C677T 基因型频率分别为 C/C 20.4%、C/T 54.5%和 T/T 24.8%，回族为 C/C 8.2%、C/T 88.
2、4%和 T/T 3.4%，二者差异有统计学意义(P0.005)。回族男性该基因型频 率分别为 7.1%、88.6%和 4.3%，女性为 9.2%、88.2%和 2.6%(P0.05)；汉族男性为 26.0%、46.3%和 27.7，女性为 17.4%、59.1%和 23.5%(P0.05)。结论 宁夏地区回、汉族 MTHFR C677T 的三种基因型 CC、CT、TT 的分布存在差异，三种基因型的 分布在性别间未见差异。 【关键词】 回族；汉族；宁夏；5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶； 遗传多态性Abstract：Objective To investigate the frequencies
3、of the allele and genotype of MTHFR C677T between Hui and Han Population in Ningxia. Methods Restriction fragment length polymorphism (PCR- RFLP) and direct DNA sequencing were used to detect the genetic genotype. The genetic polymorphism distribution of MTHFR C677T between the 146 Hui nationalities
4、 and 169 Han nationalities in Ningxia were compared. Results The genotype frequencies of MTHFR C677T in Han population were C/C 20.4%,C/T 54.5%,T/T 24.8% and in Hui population were C/C 8.2%, 88.4%, 3.4% respectively. The genotype frequencies of male and female in Hui were 7.1%, 88.6%, 4.3%；9.2%, 88.
5、2%, 2.6% respectively. And the genotype frequencies of male and female in Han were 26.0%, 46.3%, 27.7%；17.4%, 59.1%, 23.5%, respectively. Conclusion There is a significant difference between Ningxia Han and Hui in genetic polymorphism distribution of the MTHFR C677T (P0.05). And there is not a signi
6、ficant difference between male and female both in Ningxia Hui and Han of genetic polymorphism distribution of the MTHFR C677T (P0.05).Key words：Hui population；Han population；Ningxia；510- methylenetetrahydrofolate reductase；genetic polymorphism5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methy lenetetrahy drofolate reductase，MTH
7、FR)是一种重要的叶酸代谢酶，它在体内催化 5，10- 甲基四氢叶酸还原为体内最主要的甲基供体-5甲基四氢叶酸，具 有重要的生理功能。至今已发现 MTHFR 基因有 15 种导致改酶缺陷的突变1，其中 C677T 突变导致酶的热不稳定性缺陷，可引起 高半胱氨酸血症，并与多种疾病的发病风险有关2。正常人群中 MTHFR 基因第 677 位核苷酸多态性的分布存在群体差异，这种差 异可能与人群对多种疾病的群体易感性有关。宁夏回、汉族人群该 位点的分布特征尚未见报道。本研究旨在分析宁夏回、汉族人群 MTHFR C677T 的分布特征，获得该多态性位点的宁夏群体遗传学 数据。1 材料和方法1.1 研究对
8、象研究对象均来自三级甲等 医院 门诊体检健康且祖居宁夏的回、 汉族个体。回族 146 人，其中男性 70 人，年龄 1822 岁，平均年 龄(202)岁；女性 76 人，年龄 1921 岁，平均年龄(201)岁。汉 族 169 人，其中男性 54 人，年龄 1921 岁，平均年龄(201)岁； 女性 115 人，年龄 1819 岁，平均年龄(191)岁。1.2 方法1.2.1 提取外周血 DNA抽取静脉血 35mL，EDTANa02 抗凝，采用北京赛百盛基因公 司的树脂型基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA，保存于 TAE 液中(浓度为 0.1mg/L)，并置-4冰箱保存。1.2.2
9、PCR 扩增引物设计并合成根据 Frosst 等3报道的突变 cDNA 序列设计 上游引物 P1：5-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGG GA-3；下游 引物 P2：5-AGGACGGTGCGGTGAAGAGTG-3采用多聚酶链 反应限制性内切片段长度多态性(PCR-RFLP)方法。PCR 反应体系总 体积为 50L，含 ddH2O35L，10buffer(Mg2+)5L，10 pmol/L， 引物各 1.5L，100mol/L dNTPs1L，TagDNA 聚合酶 1L。PCR 反应条件：94预变性 5min，94变性 30s，63退火 30s，72延 伸 30s，33 个循环后，再
10、延伸 7min。PCR 产物为 198bp 的 DNA 片 段，用 1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 扩增结果，紫外灯下鉴定。1.2.3 HinfI 酶切及产物鉴定在 20L 反应体系中进行酶切，ddH2O 5L，Buffer 2L，PCR 产 物 12L，HinfI 酶 1L，37水浴 4h，酶切产物由 12聚丙烯酰胺 凝胶电泳后，goldview 染色观察结果。经 HinfI 酶切产生 3 种基因型， 分别为野生型(CC)、杂合突变型(CT)、纯合突变型(TT)。产生的多 态性片段分别为 198bp、198bp 和 175bp、23bp，以及结果 175bp、23bp。酶切结果(图 1)
11、，经北京利嘉生物公司测序结果(图 2，见封 2)。2 结果2.1 群体代表性检验 宁夏回、汉族及男女的 MTHFR C677T 基因型和等位基因的 分布，经 2 检验，P0.05，符合 Hardy-WEinberg 平衡，表明研究 对象来自同一群体，具有较好的代表性。M：Marker 为 500/400/300/200/100/25bp，最亮为 400bp，其中 1 和 4 泳道为杂合突 变型，为 198bp 和 175bp；2 和 3 泳道为纯合突变型，为 175bp；5 泳道为野生型，为 198bp。转贴于 .com2.2 宁夏回、汉族 MTHFR C677T 基因型和等位基 因型的频率分
12、布 宁夏地区回、汉族 MTHFR 的 3 种基因型 CC、CT、TT 的分 布差异具有统计学意义(P0.05)，回族正常人群 T 纯合型突变频率 较低，低于宁夏汉族正常人群(见表 1)。表 1 宁夏回汉人群 MTHFR C677T 基因型频率的比较（略）2.3 宁夏回汉不同性别的 MTHFR C677T 基因型频率分布 宁夏地区回族男、女和汉族男、女的 MTHFR 基因型 CC、CT、TT 的分布差异无统计学意义，P0.05(见表 2)。表 2 宁 夏回汉不同性别的 MTHFR C677T 基因型频率分布（略）3 讨论人类 MTHFR 基因定位于染色体 1p36.3 上，cDNA 全长 2.2
13、kb， 含有 11 个外显子和 10 个内含子，且具有高度多态性。由于 C677T 位于 MTHFR 催化区域，该突变直接 影响 亚甲基四氢叶酸还原酶 的活性和耐热性，因此 目前 很多疾病的 研究 都集中在此多态性 位点上。据 文献 报道，MTHFR 基因 C677T 突变分布在爱尔兰正 常人群中 T 纯合型突变频率约为 6.1，荷兰人约为 5.2，法籍加 拿大人约为 124，欧洲人约为 355，而在美国，Hanson 等6调查了 1238 名受试者，T 纯合型突变约占 11.4，杂合型 突变 47.2，野生基因型 41.3。亚洲各地分布也不尽相同，泰国 人中 T 纯合基因型约占 1.4，杂合
14、基因型 25.6，远低于韩国和日 本，与非洲黑种人接近7。在 中国 ，Zheng 等8调查了 122 名正常受试者约 12.3(95CI 6.319.6)为 T 纯合基因型。 Zhang 等9 分析 了 100 例中国南方正常人群 MTHFR 基因 C677T 突变频率 T 纯合基因突变频率为 16。Sun 等10对 96 例西安汉族人进行基因分型后发现，西安地区汉族人其 C677T 等位 基因频率为 45，TT 纯合子占 18，C677T 等位基因及突变纯合 子 TT 频率高于日本人和非洲美洲人。许海燕等4调查显示中国 人群中 T 纯合基因型频率约为 20.5。由此可见，MTHFR 基因在 人群分布呈遗传多态性。本研究结果显示宁夏地区回、汉族正常人 群 MTHFR C677T 3 种基因型频率 C/C、C/T、T/T 分别为8.2%、88.4%、3.4%；20.7%、54.5%、24.8%，表明宁夏地区汉族正 常人群与国内报道的北方地区 T 纯合型突变频率接近，且突变频率 较高，男女性别差异无统计学意义(P0.05)。而宁夏地区回族正常 人群 T 纯合型突变频率较低，显著低于宁夏汉族人群与爱尔兰和荷 兰人接近，且男女性别差异无统计学意义(P0.05)。本文为进一步 研究 MTHFR C677T 基因多态性与疾病相关性研究提供了 参考 。【
