《蛋白质杂交》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质杂交（50页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、Western blot 实验技术,易发平 基础医学院生物化学与分子生物学教研室,定义：,印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,Western Blot基本原理,在电场
2、的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 1.水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。盐析沉淀出的蛋白质一般保持着天然构象。常用的中性盐是硫酸铵。细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2g/mL
3、 Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin ， pH8.0,蛋白样品的制备,2.低温有机溶剂提取法蛋白质处在一定量的有机溶剂中，分子间极性基团的静电引力增强，水化作用降低，蛋白质聚集而沉淀。对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。该法沉淀蛋白质的选择性较高，不需脱盐。 3.水溶性多聚物沉淀法聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（DEX）等溶于水中，蛋白质的极性基团与多聚物分子中的氧或氢氧根结合，形成二者的复合体，从溶液中沉淀析出。改变多聚物的浓度可分段沉淀出不同的蛋白质。 4. 通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白,重组蛋白的特点：目的蛋白质的量较多，
4、至少点总蛋白量的1%，常为5%-9%，使纯化易于进行。 可利用融合蛋白质的特性进行纯化。利用标示物（tag）的特性，用亲合层析柱，可快速分离纯化融合蛋白质，最后切除tag即可。很多表达载体已带有tag的DNA序列。,重组蛋白的特点： 包含体的形成。主要出现在大肠杆菌等原核生物中，溶解度很小的蛋白都进入包含体中，包含体中的蛋白质主要是外来性的重组蛋白。离心的方法先收集包含体，再从中分离蛋白。分泌蛋白质的生成。目的蛋白前加入信号肽序列，可使真核细胞内表达的蛋白分泌到培养基中，因其中的蛋白质种类较少而使目的蛋白的分离纯化得以简化。大肠杆菌等有细胞壁的细胞可分泌至周质中，收集细胞后，改变渗透压，同时加
5、入少量溶菌酶破坏细胞壁，提取周质后，纯化目的蛋白。,蛋白样品的定量,生物化学所学的方法都可以。凯氏定氮法、双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。 凯氏定氮法：蛋白质中氮在浓硫酸作用下生成铵盐，与浓NaOH作用，产生氨气，吸收于标准硼酸溶液中，用标准酸直接滴定，测出含氮量，按蛋白质恒定的含氮量（16%），换算出蛋白的含量。 福林-酚法（Lowry法）：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸残基与Cu2+结合，生成复合物，进而还原酚试剂的磷钼酸，生成蓝色化合物，用比色法测定。,蛋白样品的定量,紫外吸收法：蛋白质在280nm左右有吸收高峰（因色氨酸和酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量各异，
6、因此A280值不同。 Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。(上样量) 其他商品化的试剂盒也可测蛋白含量。,蛋白样品的定量,试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（ 将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml, 3.5mg/ml, 3.0mg/ml, 2.5mg/ml, 2.0mg/ml, 1.5mg/ml, 1.0mg/ml, 0.5mg/ml。）,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS聚丙烯酰
7、胺凝胶电泳,原理： 蛋白质进行PAGE时，其迁移率取决于所带的净电荷量以及分子的大小、形状等因素。如在胶中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白分子中的二硫键还原。 SDS使蛋白的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。大量的SDS结合后，各种蛋白都带上相同的负电荷，大大超过了蛋白原有的电荷量，因而原有的电荷差别可忽略。所以，蛋白质的迁移率主要取决于它的分子质量。,丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺（Bis） 聚合而成的分子筛，孔径大小由二者的总浓度及Bis的浓度决定。Bis一定的情况下，总浓度越高，孔径越小。 TEMED 过硫酸铵（APS）(时间) TEMED 及AP
8、S激发网状结构的形成。分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。所以凝胶液需排气，在水或水饱合异丁醇隔绝空气的条件下反应。 SDS 配胶的Tris缓冲液 Tris-甘氨酸电泳缓冲液,凝胶成份,凝胶浓度与蛋白分离范围,浓缩胶浓缩蛋白质的原理,在不连续SDS-PAGE时,采用了两种缓冲液浓度、pH值和凝胶孔径，上层胶为浓缩胶（大孔径），下层胶为分离胶（分子筛）。浓缩胶中的缓冲对为Tris-HCl，电泳Buffer的缓冲对为Tris-甘氨酸。电泳时，胶中的Cl-移动最快， 电泳缓冲液中的甘氨酸（pI为6.0）在浓缩胶pH6.8时解离度很小，故移动最慢。而SDS-Protein 在无分子筛效应的大孔径浓缩胶中
9、移动速度居第二。即泳动速度为Cl- 蛋白甘氨酸离子。随着电泳的进行， Cl-与后面的蛋白带之间形成电势梯度，同样的蛋白与甘氨酸离子之间也会形成电势梯度。高电势使蛋白质和甘氨酸离子的移动速度加快，形成一个迅速移动界面。由于蛋白质的有效泳动度居第二，使蛋白质聚集在这个移动界面附近，被浓缩成一狭窄的中间层。所以，加样后，通过此浓缩过程，都能形成一狭窄的区带。,电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 *预染蛋白质分子量标
10、准包含了从19kD到117kD共6种纯化的预染蓝色蛋白质，可以直接使用，无需煮沸。每次上样5-10微升，就可以在电泳时、电泳后或转膜后观察到非常清楚的蛋白条带。,1）电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥，电压越小，条带越漂亮。,转膜,膜的选择,尼龙膜,硝酸纤 维素膜,封闭非特异性抗体结合麻烦,简单快速封闭非特异性抗体结合,价格昂贵,价格便宜,特殊要求下的选择,需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜： 480g/cm2 ；硝酸纤维素膜：80g/cm2 ）,目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱,需要更大的机械强度,PVDF膜,蛋白结合量最高，机械强度也高，其上的蛋白可用染料染色也可免疫显色，但使用前需
11、处理。特别适于氨基酸组成分析和序列分析。,转膜,半干法 按：用缓冲液湿润滤纸3张、膜、凝胶、缓冲液湿润滤纸3张顺序放置，电转1030min。但高分子量的蛋白转移效率较低。湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。,具体条件需考虑蛋白分子大小及样品中蛋白实际含量高低。,转膜后检测,丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜，换水几次，脱色。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的 Western印迹过程。,封闭,脱脂奶粉（5） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,目的：防止抗体与膜的
12、非特异性结合。,封闭液选择,在进行抗体杂交之前，需要采用异源性蛋白质先对转印膜进行封闭，防止免疫试剂的非特异性吸附，从而降低背景，增加灵敏度，提高信噪比。常用封闭物有脱脂奶粉和BSA（稀释于不同的缓冲液中），但不同的抗原-抗体反应，封闭条件均不相同。 牛奶封闭液可能含有能与抗山羊类抗体交叉反应的IgG, 由此产生非特异性背景。建议使用casein（年奶中的酪蛋白）或BSA做封闭。,一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37一小时，4 过夜。 洗去未结合的一抗：回收一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10mi
13、n。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37一小时，4 过夜。 洗去未结合的二抗：倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。,回收一抗溶液？,在Western或免疫荧光染色等操作后，请注意回收稀释的抗体。回收的抗体在进行Western或免疫荧光染色时至少可以重复使用10次。稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释抗体，4保存。 回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10000g离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。,一抗选择,免疫组化时抗体识别的是未经变
14、性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。 单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高。但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之一； 多抗：虽然存在交叉反应的问题，但由于识别多个抗原表位，所以即使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结
15、果，这是多抗的优点之一。,二抗算不算多余？一抗不能显色吗？,一抗是特异性的，常用单抗。二抗要求广谱抗体，最好能够一对多。 一抗如果是鼠抗人的抗体，二抗应该是另一种动物抗鼠的抗体，而且一抗和二抗的动物种属原则上不应该相同。一般来说，一抗多用兔抗和鼠抗，而二抗多用羊抗。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP),在同一张膜上检测目的蛋白和内对照（-actin，GAPDH ），应先上目的蛋白的一抗、二抗，显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，显色、压片、洗片。,DAB、 ECL法都能达到纳克的要求。ECL是一种增强显色法，灵敏度要高
16、，但显色麻烦，发表文章常用。 DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。 Ecl 显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。 注意：荧光在一段时间后会越来越弱。,常用显色法的原理,成功的例子,A.RT-PCR; B. Western blot C.Col I mRNA 数据分析 D. Col I蛋白数据分析,杂交结果的分析,Western blot 可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量和半定量分析，但是不能定位。 定量Western Blot技术需要具备两个必要条件。其一：信号必须稳定，保证不同时间点检测都可以得到相同的结果；其二：信号的强弱必须与目标蛋白深度成比例关系。 利用红外激光器产生的激光激发红外荧光染料，产生的发射光由高灵敏度光电二极管检测荧光信号强度。荧光信号一经激发出来就是稳定的，不随时间变化；荧光强弱与目标蛋白浓度成比例关系（浓度越高，结合的染料越多，荧光信号越强），根据荧光强弱就可以对蛋白进行精确的定量分析。,
