核酸分子杂交-2010-12-27

《核酸分子杂交-2010-12-27》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸分子杂交-2010-12-27（75页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、1,核酸分子杂交,Nucleic Acid Hybridization,2,主要内容 1 核酸分子杂交的基本原理 2 核酸分子杂交的基本方法 3 生物芯片技术 4 核酸探针的制备及标记 5 影响核酸分子杂交的基本因素,3,核酸分子杂交技术的发展史,Hall等1961年的工作开始的，探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。,Bolton等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。,60年代末，Britten等研究液相中DNA的复性以比较不同来源核酸的复杂度，用UV260nm的吸光度来监测互补链的复性程度。,60年代中期Nygaard 等将DNA或RNA探针

2、固定在硝酸纤维素（NC）膜上。Brown等应用这一技术评估了爪蟾rRNA基因的拷贝数。是现代膜杂交实验的基础。,固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生。,70年代末期到80年代早期，分子克隆成为可能。可以从基因组DNA文库和cDNA文库中获得特定基因克隆，制备大量的探针DNA,1975年英国爱丁堡大学的Southern建立了Southern印记杂交技术，用于转化子的分析。,4,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993. “for their discoveries of split genes“,2006年上海交通大学微生物研究所,5,鸡卵清蛋白

3、成熟mRNA与DNA杂交电镜图,法国科学家Chambon的遗憾,6,鸡卵清蛋白基因,hnRNA,首、尾修饰,hnRNA剪接,成熟的mRNA,鸡卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰,7,第 一 节,核酸分子杂交 的基本原理,8,核酸分子杂交是基于核酸分子的变性和复性原理的基础上产生和发展起来的。,9,DNA变性是指在物理或化学因素的作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使双链DNA分子变成两条单链DNA的过程。,一、DNA变性与复性,10,引起核酸变性的因素,酸 碱,热,变性剂 （尿素 酰胺）,有机溶剂 （乙醇 丙酮）,11,变性后DNA 其它理化性质变化,增色效应 粘度下降 酸碱滴定曲线改变

4、 生物活性丧失,12,OD260（A260）,13,增色效应：DNA变性时，其溶液OD260增高。,14,Tm：双链DNA变性一半所需要的温度称为解链温度或融解温度（melting temperature, Tm）。不同的DNA具有不同的Tm值，一般为7085，其大小与G+C含量成正比。,热变性,15,16,DNA的复性（renaturation）,变性DNA在适当条件下，两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。,减色效应：DNA复性时，其溶液OD260降低。,定义：,17,复性过程中的碱基配对,18,DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度,

5、影响复性速度的因素：,19,20,核酸分子杂交：,不同来源的具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。,DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA,探针,待测核酸,分类,21,应 用： (1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； (2)用来揭示核酸片段中某一特定基因的存在与否、拷贝数及表达丰度。,22,第 二 节,核酸分子杂交 的基本方法,23,液相杂交,固相杂交,原位杂交,Southern blot（检测DNA）,Northern blot（检测RNA）,斑点杂交/狭缝杂交,24,三种印迹技术的比较,Southern blot,Northern blot,W

6、estern blot,25,是指将电泳分离、原位变性的单链DNA片段转移到固相支持物上，然后，与核酸探针杂交，检测DNA的方法。,一、Southern Blot,26,带有DNA片段的凝胶,DNA分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,转膜,杂交、显影,凝胶,滤膜（尼龙膜/硝酸纤维素膜）,吸附有DNA片段的膜,Southern 印迹杂交的技术流程,胶内变性,27,基本步骤,DNA制备、酶切,电泳分离,原位DNA变性,DNA转膜,预杂交、杂交、洗脱,杂交结果检测,（二） 待测DNA样品的电泳分离,（三） 凝胶中核酸的变性,（四） Southern 转膜,（一） 待测核酸样品的制备,（五） S

7、outhern 杂交,（六） 杂交结果的检测,28,细胞,组织,化学试剂,裂解细胞,匀浆器,研磨破碎组织中的细胞,蛋白酶、RNA酶,消化大部分蛋白质和RNA,酚/氯仿,除去残余蛋白质,DNA,（100 kb ）,乙醇,（一）待测核酸样品的制备,29,部分消化,充分消化,限制酶消化,E,E,E,E,E,E,H,H,DNA片段：,（最长的DNA片段控制在大约2 kb）,30,（二）待测DNA样品的电泳分离,31,碱变性：DNA原位变性，形成单链分子，以便进行分子杂交。,酸中和：凝胶pH值恢复中性，以便DNA片段转移。,（三）凝胶中核酸的变性,32,（四）Southern 转膜,（250-500g）

8、,毛细管虹吸印迹法,毛细转移 真空转移 电转移,33,34,35,转移后，各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，因而称为印迹（blot）。,琼脂糖凝胶,硝酸纤维素膜,印迹（blot）,注意：做好方向标记,36,预杂交：目的是将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，降低本底，使背景清晰干净。,杂交：,预杂交液 + 探针DNA,（六）Southern 杂交,预杂交液,（五）探针的制备,37,洗膜：,高,低,1SSC: Na+浓度 0.2 mol/L,2SSC: Na+浓度 0.4 mol/L,0.2SSC: Na+浓度 0.04 mol/L,0.1SSC: Na+浓度 0.0

9、2 mol/L,Na+ 浓度,38,X-ray片,杂交膜,放射自显影,（七） 杂交结果的检测,非放射性杂化分子的检测,39,DNA分子杂交的应用:,可进行DNA片段的定位和分子量的测定,可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析,可用于检出特异的DNA片段,可用于基因文库和cDNA文库的筛选,40,分子杂交实验,41,是指待测RNA样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固-液相杂交，检测RNA（mRNA）的方法。,二、Northern Blot,42,将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再采用特定的探针进行杂交，这种杂交方法称为斑点杂交（dot blott

10、ing）或狭缝杂交（slot blotting）。,三、 斑点及狭缝杂交,43,印迹为圆形的，称为斑点印迹,印迹为线状的，称为狭缝印迹,44,用于特定基因表达的定性及定量研究 用于基因突变的分析,45,标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法称原位杂交。,四、原位杂交 （in situ hybridization）,检测基因在细胞内的表达与定位,检测染色体中特定基因的位置等,可用于基因克隆筛选的菌落原位杂交(裂菌),46,基本步骤：,原位杂交分为：,细胞内原位杂交和组织切片原位杂交,（10甲醛等）,（蛋白酶、SDS、Triton X-100）,（核素和非核素标记探针）,

11、47,菌落原位杂交,48,三种印迹技术的比较,Southern blot,Northern blot,Western blot,49,第 三 节,生物芯片技术,50,生物芯片,生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术，主要是指通过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其他生物组分的准确、快速与大信息量的检测。,51,DNA芯片 蛋白质芯片 其它芯片,生物芯片包括：,按用途分：,-样品制备芯片 -生化反应芯片 -检测芯片,52,是指将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测

12、的荧光标记样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析，从而迅速得出定性和定量的结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNA microarray)。,一、基因芯片,基因芯片(gene chip),53,基因芯片(gene chip),54,许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针,Cy3,Cy5,55,56,是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。,二、蛋白质芯片,蛋白质分子间的亲和反应,蛋白质芯片(protein ch

13、ip),蛋白质芯片作用原理,57,蛋白质芯片(protein chip),抗原芯片原理图,58,第 四 节,探针的制备与标记,59,核酸探针 （ probe ）：,探针是指带有检测标记的，能与被检测核苷酸片段互补的一段已知核苷酸片段。,cDNA探针 基因组DNA探针 寡核苷酸探针 RNA探针,探针的种类：,60,一、 合成寡核苷酸探针注意原则,(1) 长度（10-50 bp); (2) G:C对含量40%-60%； (3) 探针内避免互补； (4) 避免同一碱基连续出现； (5) 与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。,61,(1)标记前后探针基本结构、化学性质相同

14、; (2)特异性强、本底低、重复性好； (3)操作简单、节时； (4)安全、无环境污染。,二、 标记物,1 、 一个理想的标记物应满足：,62,2 、标记物的种类,32P、35S、3H、125I等,半抗原：生物素（biotin） 、地高辛（Dig） 荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC） 、罗丹明等 酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等 化学发光探针,非核素标记物,核素标记物,63,体 内 标 记,体 外 标 记,化 学 法,酶 法,三、标记方法,缺口平移法 随机引物标记法 PCR标记法 末端标记法,64,利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团（如磷酸基团）发生的化学反应将标记物直接结合到探针分

15、子上。,化学法：,65,酶 法：,OH,5,5,3,32P- dATP,生物素- dUTP orNTP,地高辛- dUTP orNTP,荧光素- dNTP,66,DNase I,5,5,3,3,5,5,3,3,DNA聚合酶5-3外切酶活力,5,5,3,3,DNA聚合酶 5-3聚合酶活力,5,5,3,3,（一）缺口平移法,- 32PdATP,67,5,3,5,5,3,3,5,3,3,5,5,3,模板,变性,合成标记,Klenow酶,（二）随机引物法,68,在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP，这样，标记的dNTP就可在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。,5,3,5,3,底 物,引物,模 板,（三） PCR标记法,69,只将标记物标记在DNA链的3末端和5末端的方法称为末端标记。,3端DNA末端标记,5端DNA末端标记,（四） 末端标记法,70,3端DNA末端标记,71,T4噬菌体多苷酸激酶,5端DNA末端标记,- 32PdATP,72,1乙醇沉淀法,2Sephadex G-50柱层析法,3微柱离心法,四、 探针的纯化,73,第 五 节,影响核酸分子杂交 的基本因素,74,核酸分子的浓度和长度：50300 bp, 0.10.5 g,2. 温度: Tm-25,