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1、水生态毒理研究组环境样品中污染物分析方法规范1 Page 1/6 地表水中六种雌激素化合物分析规范注：本方法适用于地表水、饮用水和污水中六种雌激素化合物的测定1.目标化合物天然动物性雌激素雌酮(E1)、雌二醇 (E2)、雌三醇 (E3)和作为药物使用的人工合成的雌激素类药物己烯雌酚 (DES)、乙炔基雌二醇 (EE2)、戊酸雌二醇 (EV)、乙烷雌酚、炔诺酮等在极低的环境浓度 (ng/L)下就可能对生物体造成危害。 引起了世界各国的广泛关注。 但由于研究相对滞后，美国国家环保局、 世界卫生组织和世界动物基金会均未对该类物质作出明确的规定。雌酮(E1)、雌二醇 (E2)、雌三醇 (E3)、己烯雌
2、酚 (DES)、乙炔基雌二醇 (EE2)、戊酸雌二醇 (EV)是比较常见和典型的内分泌干扰物质，本研究以上面六种雌激素为目标化合物。1.1.试剂甲醇（ Methanol） ，HPLC 级（美国 Fisher Scientific 公司） ；丙酮：色谱纯（TEDIA） ；正己烷（ n-Hexane） ，农残级（美国 Fisher Scientific 公司） ；叔丁基甲醚： J.T. Baker, US ；硅胶 （60200 目） ， 超纯 （美国 ACROS ORGANICS ） ； 中性氧化铝（50200目） ，（美国 ACROS ORGANICS） ；无水硫酸钠，优级纯，经450焙烧 12
3、 h 后置于密封广口瓶中保存备用；雌激素分析用标准物质： 衍生化试剂： N,O双（三甲基硅烷基） 三氟乙酰胺， 简称 BSTFA（FLUKA ） ，TMSI；EE(乙炔基雌二醇 )，ALDRICH ；E1(雌酮)，SIGMA ；E2(雌二醇 )MERCK ；E3(雌三醇 )，FLUKA ；EV(戊酸雌二醇 )SIGMA ；DES(己烯雌酚 )FLUKA 。剪刀、滤纸、镊子及药匙（硅胶柱净化所用）：以二氯甲烷超声清洗15min 两次、正己烷超声清洗 15min 一次；首先硅胶和氧化铝先使用二氯甲烷抽提72 小时，然后硅胶在 1802、氧化铝在 2502分别活化 12 h（activate） ；待
4、冷却至室温时，称重后装入大口锥形瓶（250 或500mL） ，加入其重量 3的蒸馏水去活性（ deactivate ） ，添加过程中应用滴管逐滴加入，边加边用力振摇以防止结块， 并超声振荡 30 min； 放置过夜，平衡后加入正己烷浸没其表面备用 （一般也需放置过夜）；玻璃滤膜，经 450焙烧 4 h，准确称重 ,放入干燥器中放置备用。1.2.仪器超声波清洗仪 (KQ250D 型数控超声波清洗器 ) 恒温水浴锅（中国科工卫仪器仪表公司）旋转旋蒸仪 (Buchi, Vac? 500/rotavapor R-200/Heating bath B-490,Germany) 水生态毒理研究组环境样品中
5、污染物分析方法规范1 Page 2/6 氮吹仪 (数控氮吹仪， KL512/5093,康林,北京) 气相色谱质谱连用仪： GC6890-MSD5973(Agilent Technologies ，美国)，使用 G1701 DAMSD ChemStation分析处理数据；毛细色谱柱： HP-5 石英毛细管色谱柱： 30 m 0.32 mm ID 0.25 m 液膜厚蠕动泵，玻璃滤膜支架，直径50mm 孔径 1.0m 玻璃滤膜 (Millpore Co., 北京联星事业公司代理 ) SPE固相萃取小柱 (HLB ，Waters Co.) 固相萃取真空装置 (12 小柱， Supco Co. 配有
6、12根聚四氟乙烯导管 ) 真空泵 (Supco Co.）100 级超净工作室；高纯氮气2.玻璃仪器及其它用品专用玻仪：鸡心瓶、 K.D 浓缩器、 8ml 定量样品瓶，层析柱（长35cm，内径 1 cm，带活塞） 、GC 自动进样的样品瓶。常规玻仪及其他用品： 100ml、50ml、10ml 量筒；200ml、100ml、50ml 烧杯；500ml、50ml试剂瓶；胶头滴管、玻璃漏斗、玻璃棒；100ml、50ml 三角瓶（带塞）；药匙、 5 ml 移液管、微量进样器、乳胶手套、布手套等。10 L, 5L 棕色玻璃采样瓶若干。所用玻璃仪器均以10的稀硝酸浸泡过夜， 再以重铬酸钾洗液润洗浸泡20mi
7、n 以上，分别用自来水、蒸馏水冲洗干净，在烘箱中110烘干；GC 自动进样的样品瓶、标准样品瓶、层析柱必须用铬酸洗液浸泡一段时间后再认真冲洗干净烘干，并在400?C高温烘烤 2 小时以上。3.样品采集与保存使用棕色玻璃瓶采集水样(对于不同的水样，采集体积不同，对于地表水采集4L;对于污水采集 2L;对于自来水采集 10L，对于非地表水采样要求大体积样品都采用24 小时连续采样技术，间隔 1 小时采样 1 次，采完后混匀 )，注明采样时间、采样地点、样品编号、样品名水生态毒理研究组环境样品中污染物分析方法规范1 Page 3/6 称、采样人姓名等；加入0.5的甲醇 (抑止微生物活性，保持目标化合
8、物溶解状态)；对于自来水加入 40 mg/L 的硫酸钠除氯；同时可以根据需要使用6N 的 HCl 调整水样的 pH 到3.0。样品运回实验室后保存于冰箱（4）中，密封保存 (注意避光 )，在存放样品时，应尽量注意存放在没有有机气体干扰的区域，以免交叉污染。所采样品在7 天内前处理完毕，一个月内分析完毕。4.样品制备4.1.过滤与颗粒物样品的收集使用 Millpore 整套过滤装置和玻璃滤膜过滤水样，首先将过滤后的滤膜和颗粒物收集，冷冻干燥，用铝箔收集放入冰箱中备用；其次将过滤后的水样，准确量取2L，加入回收率指示物氘代雌激素 E2d3 (加入浓度根据当地污染程度确定，原则是与样品中目标污染物浓
9、度相接近 )，充分摇匀备用。4.2.富集采用 500mg 的 HLB 固相萃取柱 (SPE)用于水样的富集。先安装好真空抽滤装置及固相萃取装置， SPE 柱在使用前依次用叔丁基甲醚（二氯甲烷）、甲醇、蒸馏水各5mL 清洗,每次加液后保持 5min，开真空泵抽取液体，应控制流速，使液体从萃取柱呈滴状滴出(在清洗时，放出试剂在柱填料的表面应保持一个液面，防止流干，蒸馏水的清洗方式同样)。处理完后小柱处于活化状态。调节好真空度(真空度应小于20 毫米汞柱 )，使水样过柱的流速恒定在10mL/min。富集完毕后，将水抽干，用氮气吹干(或使用高速离心机甩干 )。富集完后如不能马上洗脱，应将小柱用铝箔包好
10、，放至冰箱（4）保存，作好编号。4.3.清洗富集完毕后， 分别用 5ml 甲醇/水（4:6, v/v） ，5ml 纯水，5ml 甲醇/氨水/水（10:2:88） ，5ml纯水清洗，然后抽干。4.4.洗脱吹干后的小柱，放在真空装置上，下面用K-D 浓缩器承接，以 10mL 甲丁醚 /甲醇（9：1，V/V ）洗脱，混合液为洗脱剂分两次淋洗。注意HLB 固相萃取柱填料上界面始终不能接触空气。用微弱氮气流吹到0.5mL 左右，留待净化。4.5.样品净化与浓缩：在干净的（内径为 10mm）内采用正己烷湿法装柱，先装3cm硅胶，再装 3cm 氧化铝。水生态毒理研究组环境样品中污染物分析方法规范1 Page
11、 4/6 注意在装柱过程中，要不断加入正己烷以免氧化铝粘附在管壁上。保持正己烷以适当的流速不断的流出，并保证正己烷液面始终高于柱填料界面，同时不断用洗耳球轻轻敲打管壁，使柱填装紧密，不断层。然后调节正己烷液面正好处于氧化铝层面之上，将 0.5mL 待净化富集样品从K-D 浓缩器转移到净化柱中，用2mL 丙酮/甲醇（ 5：5，V/V ） 混合液分三次清洗盛样品的K-D 浓缩器，转移到净化柱中，用 10ml 丙酮/甲醇（5：5，V/V ） 洗脱，然后以 60 滴/min 左右的流速流出， 直到液面刚好处于氧化铝层面之上。洗脱液用 K-D 浓缩器收集，用微弱氮气流吹干，加入80ul 衍生试剂，用正己
12、烷定容到0.5mL，水浴 60加热 30min，转移至样品瓶中，备GC/MS 分析。5.分析测定方法5.1.色谱条件所有样品均在气相色谱 -质谱联用仪 GC6890-5973MSD 上分析。 HP-5MS 石英毛细管色谱柱（60m0.25mm0.25 m） ，He 为载气，流速恒定为1mL/min，线速度 26cm/sec ；进样口 280，MSD 280，电子能量： 70eV；SIM 模式下程序升温： 100起以 10/min 速度升到 300，保持 3min；无分流进样 1 L；溶剂延迟： 6min。5.2.定性与定量通过检索 NIST 质谱谱库和色谱峰保留时间进行定性分析，并采用外标峰面
13、积法、6 点校正曲线定量。6.质量保证与控制 (QA/QC) 体系6.1.质量保证 /质量控制目标：6.1.1. QA:Quality Assurance, 准确性、精密性、可比性6.1.2. QC:Quality Control,较高的可靠性6.1.3. MDL:在 99%以上的置信度，某物质可被可检出和报告的最低浓度。应至少分析 3 个以上的含预计方法限浓度 3-5 倍的目标化合物的搀混样品获得 MDL6.2.质量保证 /质量控制体系要求：6.2.1. 质量控制样品：空白样品，空白加标样，基质加标样，重复样(每 20 个测试样品同时完成一组质量控制样品的测试)。6.2.2. 目标化合物回收
14、率：通过空白加标样品的测定，得到目标化合物的回收率。水生态毒理研究组环境样品中污染物分析方法规范1 Page 5/6 6.2.3.仪器检测限 (IDL) ：测定空白样品 (n=6)的 5 倍最小噪音 (noise), 仪器检测限 (IDL) 等于3.36 乘以 5 倍最小噪音的标准偏差 (n=6),验证仪器状态。6.2.4.方法检测限 (MDL): 基质加标样 (n=6)测定，根据 U.S.EPA方法检测限测定公式计算出本实验流程 (方法)对各种目标化合物的检测限， 判断本实验方法对实际样品中目标化合物检测数据的可信度。6.2.5.校正曲线：内标 (I.S)定量法 . 多点校正 (n=6),要求 RRF 的 RSD%AbundanceTIC: 50PPB.DEvE3EE2E2E1DES(2)DES(1)
