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1、分子标记及其在植物遗传育种中的应用,遗传标记 （genetic marker）具有多型性 易于鉴别 与目标基因紧密连锁,性状标记色泽， 形态细胞学标记倒位，易位，G/N/C带生化标记同功酶分子标记RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP ,基础- 基因表达 结果 表现型,DNA碱基 序列变异,形态标记,遗传学上稳定、可见的外部特征 -遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。 如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。 特点：直观简单 从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。,细胞学标记,染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、
2、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C带、N带、G带等）。 随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。 特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。,生化标记贮藏蛋白和同工酶,贮藏蛋白 同工酶 特点：经济、方便、成本较低 结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。,分子标记,本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点： （1）不受季节、环境、基因表达与否的限制； （2）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3）数量丰富，多态性遍及整个基因组； （4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达
3、，与不良性状无必然的连锁； （5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。,分子标记的分类（Staub等1996）,植物遗传研究中常用的分子标记,RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RAPDRandom Amplified Polymorphic DNAs (DAF, AP-PCR) SSR Simple Sequence Repeat AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism,RFLP,原理： DNA 限制性内切酶酶切电泳 转移到硝酸纤维素滤膜 同位素或非放射标记（如地
4、高辛等）的探针杂交 胶片放射自显影，显示酶切片段大小,酶切：3-5ug DNA，以10U内切酶酶切5小时 电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时 染色：EtBr染色20分钟 变性：0.25M HCl 20分钟，抽真空，水冼 印迹：加入0.4N NaOH，进行Southern 印迹 冲洗：以2SSC 冼胶，风干,酶切电泳印迹,杂交洗脱,预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5 HSB、Denhardt）中， 封好后置65温箱中振荡56小时。 杂交：预杂交液中加入标记好的marker和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置65温箱中振荡过夜。 洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65 振荡洗脱两
5、次（15min/次），吸干包好。,放射自显影,将洗脱好的杂交膜置于增感屏上, 于暗室中将 X-光片放于杂交膜上， 再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置-70超低温冰箱中曝光10天左右。 使用磷屏仪，操作更方便。,RFLP探针,来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA）探针 cDNA探针:保守性较强，探针检测的多态性频率较低。 gDNA探针:检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。 玉米RFLP探针：http:/www.maizegdb.org/probes. Html,探针标记随机引物法,25 ng变性DNA 5ul 寡聚核苷酸 2ul BSA 3ul -32PdCTP 2ul
6、 Klenow酶 加水至50ul，37温箱中标记2小时,RFLP标记特点,共显性，可以区别纯合和杂合基因型 稳定、重复性强 某些植物中开发探针已遍及整个基因组 缺点：DNA需要量较大，技术复杂；用于做图较费时，难以分析大量样品；在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低。,RAPD,原理： 用一个随机引物（8-10bp）、碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组DNA，然后电泳分开扩增片段。,Polymerase Chain Reaction-PCR,3,5,TCATGA,CGAGCG,DNA is doubled with each cycle,RAPD的操作,PCR
7、反应：DNA（20ng/l） 1lPrimer 15ng10Buffer 2.0lMg2+（25mM） 1.2lTaq酶（5U/l） 0.15ldNTP（25mM） 0.2l加水至20l，再加入石腊油，进行PCR扩增,Step1 95 2分钟 Step2 95 15秒 Step3 36 30秒 Step4 72 45秒 Step5 GOTO Step2 46循环 Step6 72 5分钟,PCR扩增：,主要特点,无需杂交，设计引物也无须知道序列信息； DNA需要量少，引物便宜，成本较低； 技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。 不同物种间引物通用； 缺点：大多显性遗传，
8、不能鉴别杂合和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低。,DAF (DNA amplification fingerprinting)：,与RAPD不同的是: 引物浓度更高，引物长度更短（一般58个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，通常会产生非常复杂的带型，谱带信息比RAPDs大得多。（Caetano-Anolles等，1990）,AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction),引物较长（1050bp）； 引物浓度较高； 引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物（如M13通用测序引物）。,ISSR,共同优点：在不需要知道所扩增D
9、NA序列情况下，产生DNA片段的指纹；需DNA量少，产生多态性丰富。缺点：对反应条件非常敏感，重复性差。,SCARs （Sequenced Characterized Amplified Regions）,为提高RAPD标记稳定性，把目标RAPD片段克隆测序，根据片段两末端的序列设计特定引物（通常24个碱基），再进行PCR扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。 具有更高的可重复性 共显性,微卫星标记(SSR),真核生物基因组普遍存在，呈随机分布,大约每隔10-50kb就存在一个SSR. 哺乳动物中约为植物的5-6倍;植物中平均23.3kb有一个SSR;双子叶植物SSR数量大于单子叶植物,核DNA
10、SSR数量多于细胞质DNA; 根据核心序列碱基数的不同,可分为单碱基、2碱基、3碱基、4碱基等多种重复型。,不同物种其重复序列及重复单位频率不同。 通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNA SSR(1-4bp)的搜索,发现： (AT)最丰富,然后依次是: (A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT) n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。 同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。,SSR的分布特点,SSR的功能,长期以
11、来一直认为SSR是转录哑区，没有明确的生理功能。但随着研究深入，证明并非如此。SSR的主要功能: 编码氨基酸； 染色体末端的SSR，有保护DNA完整性、避免降解、融合及丢失的功能； 提高或降低临近基因转录速率； 基因重组的热点，是基因变异的来源； 部分SSR可产生转录启动复合物或活化染色体,两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。 不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。,SSR分析,SSR分子标记的创制,基因组文库的构建 探针制备-预杂交-带有SSR克隆的选择 测序 引物设计 检测其它方法:
12、 EST-SSR、相关种间SSR. .,Cross-species SSR,Taxonomic Transferability PolymorphismDivergence % (N) % (N)Same subgenus 89.8 (521) 78.3 (299) Same genus 76.4 (1800) 86.0 (773) Same alliance 45.4 (403) 50.4 (141) Same family 35.2 (1683) 58.4 (363),SSR的操作,PCR反应： DNA（20ng/l） 4l Primer（1mM） 0.25l 10Buffer 2.0l
13、Mg2+（25mM） 1.2l Taq酶（5U/l） 0.1l dNTP（25mM） 0.2l 加水至20l,混合后，进行PCR扩增：Step1 95 2分钟 Step2 95 30秒 Step3 56 30秒 Step4 72 60秒 Step5 GOTO Step2 31循环 注：SSR引物退火温度在52-65 不等。,SSR的特点：,两侧顺序保守，在同种间多相同； 数量丰富，在整个基因组均匀随机分布； 实验重复性好，结果可靠； 多数SSR增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异； 共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子； 仅需微量组织，适合PCR分析半自动化,相对的物种专一性； 由于开发时需
14、针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长； 实际分析时一般每次只分析单个位点； 不同引物退火温度不同，需要探索。,不足：,SSR的检测,琼脂糖凝胶检测（同前） 聚丙烯酰胺凝胶检测 一般采用银染、荧光检测。,银染检测程序,脱色：加1升10%HAC液，脱色20分钟 冲洗：用重蒸水冲洗胶板2次，每次5分钟 染色：加染色液(1%AgNO3，0.075%甲醛)30分钟 冲洗：用重蒸水冲洗胶板不超过5秒钟； 显影：预冷显影液（30g/LNaCO3，0.075%甲醛，0.4mg/mlNa2SO3），轻摇到带纹出现； 定影
15、：在固定/停止液并轻摇3-5分钟； 冲洗：用重蒸水冲洗2次，每次2分钟； 干胶：室温下自然干燥过夜。,AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism),原理：基于RFLP技术和PCR技术的结合,DNAMseI -MseI MseI -EcoRI EcoRI -EcoRIMseI -MseI片段环化，不利小片段扩增； EcoRI -EcoRI 引物的退火温度高； MseI -EcoRI 片段优先扩增,酶切连接,接头序列,Mse 接头、Pst 分别为： Mse： 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 3-TACTCAGGACTCAT-5 Pst： 5-CTCGTAGACTGCGTACC-33-CTGACGCATGGTTAA-5 EcoR：5-CTCGTAGACTGCGTACC-33-CTGACGCATGGTTAA-5,M00:5-GATGAGTCCTGAGTAA-3； P00:5- GACTGCGTACCAATTC-3; E00:5-GACTGCGTACCAATTC-3;MseI-primers +3: 5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3 EcoRI-primers +3: 5-GACTGCGTACCAATTCNNN-3 PstI-primers +3: 5-GACTGCGTACATCGAGNNN-3,
