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1、大学大学本本 科科 毕毕 业业 论论 文文论文题目 人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究 英文题目 Research on Preparation of Human Parathyroid Hormone Fragment Analogue 专 业 生物技术 院 部 生命科学与技术学院 学 号 姓 名 指导教师 课 题 完成场所 论文工作时间： 年 月 至 年 月1人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究目录摘要1前言2第一章 实验原理31.131.23第二章 试剂与仪器42.1 试剂42.2 仪器4第三章 实验方法53.1 XXXXXXXX53.2
2、 XXXXXX5第四章 实验结果64.1 XXXXX64.2 XXXXXXX64.3 XXXXXXXXX6第五章 讨论参考文献7致谢92人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究人甲状旁腺素活性片段前体物制备工艺的研究摘要摘要：目的 提高人甲状旁腺素活性片段前体物 Pro-Pro-Arg11hPTH(1-34)-Pro-Pro的分离纯化效率。方法 通过均匀设计法寻求目的融合蛋白的酸水解条件（温度、时间、蛋白含量，盐酸浓度）；进行二次酸水解。使用核酸蛋白检测仪及紫外可见分光光度计检测 210nm，280nm 处吸收峰，收集样品峰，对比含量及纯度差异，确定最佳检测波长。结果 酸水解最佳条件没有得到改
3、进；检测波长设在 210nm 比设在 280nm 更灵敏、更可靠。结论 二次酸水解可提高水解效率；检测波长设在 210nm 处可提高分离纯化效率。关键词：关键词：人甲状旁腺素，活性片段前体物；骨质疏松；纯化；酸水解；柱层析Research on preparation of human parathyroidHormone fragment analogueAbstract：Objective To improve the separation and purification rate of human parathyroid hormone fragment analogue Pro-Pr
4、o-Arg11hPTH(1-34)-Pro-Pro. Methods To seek the conditions for acid hydrolysis of target fusion protein through uniform design；to carry out acid hydrolysis for a second time. To detect the assimilation peak and the sample collecting peak at 210nm and 280nm with the nucleic acid protein surveymeter an
5、d the ultraviolet visible light photometer， and to contrast the differences in contents and purity to make sure the best wavelength. Results No progress was made in seeking the best conditions of acid hydrolysis; Set up the detecting wavelength at 210nm was more sensitive and credible then at 280nm.
6、 Conclusions Carrying out acid hydrolysis for a second time can improve the 3efficiency of hydrolysis; Setting up the detecting wavelength at 210nm can improve the separation and purification rate.Keywords： human parathyroid hormone; active fragment analogue; osteoporosis; purification; hydrochloric
7、 acid; column chromatography前言一、骨质疏松症以及研究开发甲状旁腺激素相关肽的重大意义骨质疏松是一个涉及多学科的公众健康问题。它是指每个单位内骨组织数量减少。分为继发性骨质疏松和原发性骨质疏松，前者最常见有类固醇性骨质疏松和糖尿病性骨质疏松等，后者主要包括绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松。原发性骨质疏松是以骨质减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。判断骨质疏松症的依据为：骨量减少；骨微结构蜕变；骨的脆性增高、骨力学强度下降、骨折危险性增加，对载荷承受力降低而易于发生微细骨折或完全骨折。造成骨质疏松的原因有：绝经后和老年性
8、骨质疏松；遗传性骨质疏松；内分泌疾患所致骨质疏松；与饮食有关的骨质疏松；药物所致骨质疏松；废用性骨质疏松；其它疾病所致骨质疏松；特发性骨质疏松1。现今骨质疏松症已成为严重威胁老年人身心健康的常见疾病，根据中国老年学学会骨质疏松学会统计，目前骨质疏松症患者人数在我国已达到 8 千万，已经构成一个严重的公众健康问题。随着人均寿命的延长，老年性骨质疏松症发病率逐年增加。同时骨质疏松症也特别“垂青”女性，在胎儿期，孩子从母体不断地吸收大量钙质，以保障骨骼的正常发育。授乳期，孩子通过母亲的乳汁得到赖以生长的钙。这时期的孕妇或授乳期母亲必须有意识地多摄取一些钙质，才能满足孩子和自身的需求。否则，不4足部分
9、便会有母亲的骨组织中溶出。在绝经期，妇女也受到骨质疏松的困扰。对于正常人，性激素对骨组织合成的促进作用和肾上腺皮质激素对骨形成的拮抗作用处于动态平衡。当性激素水平下降，而肾上腺功能并无相应程度降低，结果造成糖皮质激素相对增多，产生类似柯兴氏综合症的表现，使骨吸收大于骨形成。雌激素具有刺激成骨细胞活性促进骨基质合成的作用。雌激素缺乏不仅影响妇女的生活，更可能引发两种由于雌激素缺乏造成的疾患：心血管疾病和骨质疏松。骨质疏松造成妇女在一生中发生髋骨骨折的危险性高于其患乳腺癌、宫颈癌、子宫癌和卵巢癌危险的总和。据调查显示，60 岁以上的女性骨质疏松率高达 40%，而且随年龄段增加，比例也在上升。因此，
10、抗骨质疏松药物的研制是世界制药工业的一个热点。在目前应用的经典抗骨质疏松药物中，绝大部分为抑制破骨细胞活性的药物，如雌激素、降钙素、双膦酸盐等，但缺乏刺激成骨细胞活性或既刺激成骨又抑制破骨的作用，因而不能使骨组织恢复到正常的强度和密度2。甲状旁腺激素（parathyroid hormone，PTH）是生物体内由甲状旁腺主细胞分泌的一种多肽激素，由 84 个氨基酸组成。他是哺乳动物体内重要的钙、磷调节因子3，而PTH 的分泌也受到血钙水平的反馈调节。实验表明：PTH（1-27）仍保持有一定体外活性，而 PTH（1-26）则完全丧失体内外活性。hPTH(1-34)在体内外保持有完整 PTH 的几乎
11、全部生物活性4。而合成的牛甲状旁腺素片段（bovine parathyroid hormone fragment(1-34)， bPTH-(1-34)）比天然激素 bPTH（1-34）的活性更高。大量的临床研究表明，PTH 及其片段的小剂量多次给药具有明显的成骨作用。由于 PTH 及其相关肽不但能防止骨裂解，而且能促进骨生长，对疏松骨具有恢复作用，因此被认为是治疗骨质疏松症的第二代首选药物。二、PTH 的生物合成过程及作用机制人甲状旁腺激素是由甲状旁腺分泌的 84 个氨基酸组成的多肽，最初的转译产物是前甲状旁腺激素原（ProhPTH），由 115 个氨基酸残基构成，在分泌过程中首先在粗面内质网
12、膜周质腔被信号肽切除端 25 个氨基酸的信号肽部分成为甲状旁腺激素原（prohPTH），然后在高尔基体中切掉 6 个氨基酸的前体部分成为 84 肽成熟激素。而 845肽在体内可降解成端（1-34）肽等活性片段1。在哺乳动物中，PTH 主要生理作用是维持血钙平衡，PTH 的合成和分泌很大程度上受到甲状旁腺敏感受体介导的胞外钙浓度的调节：低血钙时，PTH 分泌到血循环系统，结合于肾和骨靶细胞上的型 PTH 受体（PTH1R，此受体被 PTH 及 PTHrP 共同分享），通过对靶细胞直接或间接的作用帮助血钙维持在一定范围。而血钙升高又抑制其分泌，但无论血钙浓度多高，均不能完全抑制其分泌。在肾脏中，P
13、TH 直接刺激肾近区小管对钙的重吸收以及刺激 1-羟化酶的活性，增加肠内 1，25二羟基维生素 D3 介导的钙吸收；在骨骼中，PTH 能诱导钙从基质中快速释放，增加破骨细胞的数目及活力，促进骨吸收，同时增加成骨细胞的数目，促进成骨细胞释放骨生长因子加速骨形成。另外，PTH 还可能通过抑制肾近区小管和远区小管对磷的重吸收十血磷浓度维持在正常范围。三、PTH 结构与生理功能的关系1978 年 Keutmann 等报道了人 PTH 的一级结构。认为 hPTH 是由 84 个氨基酸残基组成的一条多肽链分子，分子中不含半胱氨酸，故分子中不含二硫键6。Tregear 等用实验证明 PTH 发挥钙磷调节作用
14、仅需氨基端 1-34 个氨基酸残基7。园二色谱研究结果表明在水溶液中 PTH 分子是伸展的无固定的高级结构。而且不论是整个分子还是氨基片段都显示了一些 pH 依赖性，即随 pH 的变化观察到的结构也有所不同，肽链中增加了少量的二级结构。荧光研究也显示了相似的结果8。利用 1H-NMR 人们发现在第 20-24 氨基酸残基的地方有少量的规则结构，但在水溶液中仍难以观察到 PTH 的二级或三级结构。进一步用 NMR 研究表明，hPTH1-34 在 Ser3 到 Gly12 及 Ser17 到 Lys26 两处有一 螺旋结构。着两个结构紧密的区域由一段无规卷曲或螺旋结构相连19。由于 PTH 缺乏二硫键，因此在水溶液中无典型的结构。只有在非记性类膜环境中才能形成二级或三级结构，大部分多肽均形成两性螺旋结构，这样的螺旋结构在与受体结合时发挥重要作用。研究发现，人甲状旁腺素 N 端 -螺旋和 C 端 -螺旋被结构随环境而改变的连接区相连。N 端 -螺旋
