菌种与种子扩大培养

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1、第一章 菌种与种子扩大培养,1 微生物工业用菌 2 种子扩大培养 2.1 工业微生物的培养方法 2.2 影响种子质量的因素 2.3 种子扩培的实例,1 工业微生物,菌种的来源 自然界中有目的微生物分离的原则 菌种选育、分子育种 工业微生物的要求 常用工业微生物 菌种保藏,菌种来源,诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证；,从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；,基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开 发的进程。,从自然界中分离菌种的一般过程,采样, 预处理, 培养, 菌落的选择, 产品的鉴定,选择育种方法时综合考虑的因素,(

2、1) 待改良性状的本质及与发酵工艺的关系 (2) 对这一特定菌种的遗传生化的认识程度 (3) 经济费用 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术： 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。,一些常用工业微生物,抗生素生产有关的微生物,放线菌（链霉素四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,氨基酸生产菌的要求：,代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单,谷氨酸发酵的菌种：,其它氨基酸生产菌：,棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌,常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌选育而成；

3、工程菌，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌,氨基酸生产有关的微生物,食品工业微生物,包括：酿造业，酶制剂等 食品用的微生物需经过严格的毒理试验，目前已同意使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。,淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌,能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物,有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强,遗传性能要相对稳定,不易感染它种微生物或噬菌体,产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）,生产特性要符合工艺要求,工业微生物的要求,工业微生物菌种保藏技术,(1) 低温冷冻保藏； (2) 转接培养或斜面传代保藏；

4、(3) 矿物油保藏； (4) 土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。 保藏原理：创造休眠环境 保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便 保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)。,冷冻保藏：-20以下冷冻，使微生物代谢活动停止 分类：普通冷冻保藏(-20) 超低温冷冻保藏(-60一-80) 液氮冷冻保藏 冻干保藏 特点：简单有效 培养物运输较困难,冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。 特点： 冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力 冻干后的菌株可常温保存，便于运输 必须使用

5、冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等,在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞 2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜； 4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。 超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。一些细菌和真菌菌种可保藏5年而活力不受影响。,传代保藏：斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月以下保存，供试验用 矿物油保藏：将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别用于难以冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌 载体保藏：

6、麦壳，砂土灭菌后可用作载体,防止菌种衰退,衰退的表现：生长，代谢（产品） 衰退的原因：保藏不妥，不利环境，回复突变等 防止衰退的方法：合理培养条件，减少传代次数 复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件,种子：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。,2 种子扩大培养,种子扩培的目的,接种量的需要,菌种的驯化,缩短发酵时间、保证生产水平,种子的要求：,总量及浓度能满足要求,生理状况稳定，个体与群体,活力强，移种至发酵后，能够迅速生长,无杂菌污染,实验室阶段：不用种子罐，所用的

7、设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。 培养基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长 减少传代次数 孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月,生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。 培养基：控制成本，驯化；营养比发酵培养基丰富。,种子扩培的两个阶段,2.1 工业微生物培养方法,静置培养法：嫌气发酵，如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等,通气培养法,深层,浅层,固体,液体,液体,固体,工业微生物常见培养方法及其特点,2.2 影响种子质量的因素,培养基 秧龄与接种量

8、温度 pH值 通气与搅拌 泡沫 染菌的控制 种子罐级数,种子的质量要求：,一定的浓度 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH，酶活等 无污染,2.3 种子扩大培养举例,例一、谷氨酸生产的种子制备,斜面菌种,一级种子培养,二级种子培养,发酵,1、斜面 (AS1.299),培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2,培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细,培养条件：32，生长18-24小时,生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次,2. 一级种子（摇瓶）,培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250

9、ml,32培 养12小时。,培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%,培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基,3. 二级种子(种子罐),培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32培养7-10个小时,培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%,培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基,种子的质量要求：,108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束，6.887.0-7.2 活力旺盛,二、青霉素生产的种子制备,安培管, 斜面孢子, 大米孢子, 一级种子, 二级种子, 发

10、酵,一、斜面孢子,培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等,培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细,培养条件：25、7天, 注意湿度50%左右,二、大米孢子,培养基：大米及氮源（玉米浆）,培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表面积和氧的传质，营养适当（要求大米的白点小）有利于孢子的生长。,培养条件：25、7天，控制湿度,大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子,3、一级种子,培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆,目的：长菌体,培养条件：27，40小时,接种量：200亿孢子/吨,4、二级种子,培养基：同上,培养条件：27、10-14小时,接种量：10%,种子的质量要求,菌丝长稠呈丝状、菌

11、丝团很少，有中小空孢，处于期,青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期，4-6期合成青霉素的能力最强,种龄,种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。,种龄短：菌体太少；种龄长：易老化。,原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。,接种量的确定,移入种子的体积 接种量 接种后培养液的体积,过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。但是一般认为大一点好。,双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。,倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。,发酵级数的确定,一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种

12、子罐开始计算发酵级数 确定依据： 发酵规模、菌体生长特性、接种量 级数大，难控制、易染菌、易变异，难管理，一般2-4级 谷氨酸的三级发酵： 一级种子（摇瓶）二级种子 （小罐）发酵 青霉素的三级发酵： 一级种子 （小罐）二级种子（中罐）发酵,小节：,常见工业微生物的种类和用途,生产菌种的来源与保护,控制种子质量的基本方法和手段,问题：,在生产过程中如何控制种子质量？,End Thanks!,第二章 培养基及其制备,本章内容简介： 培养基原材料 淀粉水解糖的制备 糖蜜前处理 石油代粮发酵微生物工程的特征,第一节 培养基的原材料 一、培养基的营养成分及用途 光 光能自养 氢、硫、氨 自养菌 .能源

13、亚硝酸盐、亚铁盐 化能自养 碳水化合物等有机物 石油天然气和石油化工产品 功能：生长、繁殖需要；,异养菌,碳酸气 淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等 石油、正构石蜡、天然气 醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品 功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础； 豆饼或蚕蛹水解液、味精废液 .氮源 玉米浆、酒糟水等有机氮 尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等无机氮、气态氮 功能：构成菌体、含氮代谢物；,.碳源,磷酸盐、钾盐、钙盐等矿物盐 .无机盐 铁、锰、钴等微量元素 功能：构成菌体，参与酶的组成，维持酶活性，调节渗透压，调节pH值，维持氧化还原电位； .特殊生长因子：硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等 功

14、能：酶的辅助部分，维持生命活动； .水分 功能：生化反应均在水溶液中进行,二、培养基的类型 1.依营养物质的来源分类 天然培养基；（麦芽汁、玉米粉、麸皮、锯末等） 合成培养基； （高氏培养基、察氏培养基等 ） 半合成培养基； （牛肉膏蛋白胨、土豆葡萄糖培养基） 2.依培养基制成的形式分： 液体培养基； 固体培养基；,3.依培养基主要成分和使用目的来分 基础培养基 完全培养基 鉴别培养基 选择培养基 4.根据生产工艺来分 孢子培养基 种子培养基 发酵培养基 附：培养基配方举例,三、发酵培养基的选择 发酵培养基的用途与要求、成分、配比经实验确定，配制时兼顾原料来源、成本及工艺管理； 四、原料转换及

15、意义 发酵培养基中所用原材料，大部分属于粮食、油脂、蛋白质和农用肥料，其中山芋粉、玉米粉、淀粉、糊精、麦芽糖等都是可供人畜食用的粮食、油料或以粮食为原料的产品；我国人口众多，发酵产品品种和产量与日俱增，每年都消耗大量粮食、油料和蛋白质原料。 随着原料的转换，不仅要选育与原料转换相适应的菌种，同时发酵的控制方法也不相同。,第二节 淀粉水解糖的制备,一、淀粉的性质： 颗粒状态 来源，纯度 淀粉转化为葡萄糖：增重11%，还原基团 甜味 呈味物质 色泽,二、淀粉水解糖的制备方法,1.酸解法 2.酶解法 3.酸酶结合法 酸酶法 酶酸法,不同的制糖工艺生产的糖液质量差别很大,双酶水解法制葡萄糖的优点 ：

16、（1）淀粉水解是在酶的作用下进行的，酶解的反应条件比较温和。 （2）微生物作用的专一性强，淀粉的水解副反应少，因而水解糖液纯度高，淀粉的转化率高。 （3）可在较高淀粉乳浓度下水解。 （4）由于微生物酶制剂中菌体细胞的自溶，糖液的营养物质较丰富，这就使发酵培养基的组成可加以简化。 （5）用酶法制得的糖液颜色浅、较纯净、无苦味、质量高，有利于糖液的精制。,二、淀粉酸水解理论基础 淀粉水解成葡萄糖的反应过程中同时发生：水解反应、复合反应、分解反应；其中水解反应是主要的。 在淀粉糖化过程中，这三种化学反应的关系如下：,复合反应：葡萄糖分子间经1-6糖苷键结合成龙胆二糖（有苦味）、异麦芽糖和其他低聚糖（合称复合低聚糖）。 分解反应：葡萄糖羟甲基糠醛有机酸、色素等。 淀粉的水解反应 1.淀粉水解过程 H+ H+3O 进攻糖苷键的O-形成共轭酸 糖苷键断裂 2.淀粉酸水解反应动力学 3.影响酸水解的因素 酸的种类 主要因素 浓度 水解温度,