天然产物提取分离技术

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1、化学成分提取分离方法1 有效成分的提取1.1 溶剂提取法“ 相似相溶 ” 的规律是选择适当溶剂自中草药中提取所需要成分的依据之一。天然药物中的化学成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲水性有机溶剂和亲脂性有机溶剂。一些常见溶剂的脂性的强弱顺序如下：石油醚苯氯仿乙醚乙酸乙酯 丙酮乙醇甲醇水。天然药物化学成分可通过结构估计它们的极性。甙类的分子中结合有糖分子，羟基数目多，能表现强亲水性，而甙元则属于亲脂性化合物，而生物碱盐，能够离子化，加大了极性，就变成了亲水性化合物。鞣质是多羟基衍生物，列为亲水性化合物。油脂、挥发油、蜡、脂溶性色素都是强亲脂性成分。萜类、甾体等脂环类及芳香类化

2、合物因为极性较小，易溶于氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中；糖苷、氨基酸等成分极性较大，易溶于水及含水醇中；酸性、碱性及两性化合物，因为存在状态（分子或离子形式）随溶液而异，故溶解度将随pH 而改变。1.2 水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法只适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏， 与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。天然药物中的挥发油、 某些小分子生物碱如麻黄碱、 烟碱、槟榔碱以及某些小分子的酚性物质如牡丹酚等的提取可采用水蒸气蒸馏法。1.3 升华法某些固体物质如水杨酸、苯甲酸、樟脑等受热在低于其熔点的温度下，不经过熔化就可直接转化为蒸气， 蒸气遇冷后又凝结成固体称为升华。天然药物中有一些成分具

3、有升华性质， 能利用升华法直接中药材中提取出来。但天然药物成分一般可升华的很少。2 有效成分的分离与精制2.1 根据物质溶解度差别进行分离2.1.1利用温度不同引起溶解度的改变结晶法是选用合适的溶剂，将混合物加热溶解，形成有效成分的饱和溶液，趁热过滤除去不溶的杂质， 滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置，使有效成分大部分析出结晶， 由于初析出的结晶总会带一些杂质，因此需要通过反复结晶即所谓重结晶的方法，才能得到高纯度的晶体。 杂质的除去结晶法所用的样品必须是已经用其它方法提得比较纯的时候才能采用此法精制。结晶乃同类分子自相排列，如果杂质过多，则阻碍分子的排列。如果粗提取部分的纯度很差则很难得

4、到结晶。 用溶剂溶出杂质，或只溶出所需要的成分。 用少量活性炭等进行脱色处理，以除去有色杂质。 通过氧化铝、硅胶柱色谱处理（注意所需要的成分也可能被吸附而损失）。 制备其晶态的衍生物（如游离生物碱可制备各种生物碱盐类，羟基化合物可转变成乙酰化物，碳基化合物可制备成苯腙衍生物结晶）。 溶剂的选择适宜的溶剂是在冷时对所需要的成分溶解度较小，而热时溶解度较大。 溶剂的沸点亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。有些化合物在一般溶剂中不易形成结晶，而在某些溶剂中则易于形成结晶。例如葛根素、逆没食子酸（ellagicacid）在冰醋酸中易形成结晶，大黄素）在吡啶中易于结晶，萱草毒素在DM

5、F 中易得到结晶，而穿心莲亚硫酸氢钠加成物在丙酮一水中较易得到结晶。 又如蝙蝠葛碱通常为无定形粉未，但能和氯仿或乙醚形成为加成物结晶。 结晶溶液的制备制备结晶的溶液为过饱和的溶液。一般是应用适量的溶剂在加温的情况下，将化合物溶解再放置冷处。 如果在室温中可以析出结晶， 就不一定放置于冰箱中，以免伴随结晶析出更多的杂质。无定形的粉未状物质， 远较晶体物质的溶解度大， 易于形成过饱和溶液。 一般经过精制的化合物， 在蒸去溶剂抽松为无定形粉未，加入少量溶剂， 往往立即可以溶解，稍稍放置即能析出结晶。例如长春花总弱碱部分抽松后加入1.5 倍量的甲醇溶解， 放置后很快析出长春碱结晶。又如蝙蝠葛碱在乙醚中

6、很难溶解，但当其盐的水溶液用氨液碱化， 并立即用乙醚萃取， 所得的乙醚溶液， 放置后即可析出蝙蝠葛碱的乙醚加成物结晶。制备结晶溶液，除用单一溶剂外，也常采用混合溶剂。一般是先将化合物溶于易溶的溶剂中， 再在室温下滴加适量的难溶的溶剂，直至溶液微呈浑浊，并将此溶液微微加温，使溶液完全澄清后放置。 -细辛醚重结晶时，可先溶于乙醇，再滴加适量水，即可析出很好的结晶。虎杖中提取水溶性的虎杖甙时， 在已精制饱和的水溶液上添加一层乙醚放置，既有利于溶出其共存的脂溶性杂质，又可降低水的极性，促使虎杖甙的结晶化。(4) 结晶纯度的判定结晶的纯度可由化合物的晶形、色泽、熔点和熔距、薄层色谱或纸色谱等作初步鉴定。

7、一个单体纯化合物一般都有一定的熔点和较小的熔距，同时在薄层色谱或纸色谱中经数种不同展开剂系统检定，也为一个斑点者， 一般可以认为是一个单体化合物。注意，有的化合物在一般层析条件下，虽然只呈现一个斑点， 但并不一定是单体成分。例如鹿含草中主成分为高熊果甙、异高熊果甙极难用一般方法分离，经反复结晶后， 在纸层及聚酞胺薄层上都只有一个斑点，易误认为单一成分， 但测其熔点在115125，熔距很长。经制备其甲醚后，再经纸层层析检定，可以出现两个斑点，异高熊果甙的比移值大于高熊果甙。HPLC 是近年来可以用作判断有效成分纯度的一种重要手段。此外，GC、UV 光谱等，均有助于检识结晶样品的纯度。单晶 X 射

8、线分析是提供晶态下分子三维结构，确定分子的立体结构 （构型、构象等）的最有效方法。2.1.2改变混合溶剂的极性在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。在药材浓缩水提取液中加入数倍量高浓度乙醇，以沉淀除去多糖、蛋白质等水溶性杂质（水 /醇法） ；在浓缩乙醇提取液中加入数倍两量水稀释，放置以沉淀除去树脂、叶绿素等水不溶性杂质（醇/水法） ；在乙醇浓缩液中加数倍两乙醚（醇 /醚法）或丙酮（醇 /丙酮法） ，可使皂苷沉淀析出，而脂溶性的树脂等类杂质则留在母液中。2.1.3加酸碱调节溶液的pH 值对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可通过加入酸、碱以调节溶液的pH

9、 值，改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。内酯类化合物不溶于水， 但遇碱开环生成羧酸盐溶于水，再加酸酸化， 又重新形成内酯环从溶液中析出， 从而与其它杂质分离 （碱/酸法） ；生物碱一般不溶于水，遇酸生成生物碱盐而溶于水，再加碱碱化，又重新生成游离生物碱（酸/碱法） 。这些化合物可以利用与水不相混溶的有机溶剂进行萃取分离。可以分为强酸性、弱酸性和酚性三种， 它们分别溶于碳酸氢钠、 碳酸钠和氢氧化钠， 借此可进行分离。2.1.4沉淀法在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法。 铅盐沉淀法铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。醋酸铅

10、及碱式醋酸铅，能与多种化学成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。中性醋酸铅可与酸性物质或某些酚性物质结合成不溶性铅盐。因此，常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂甙、部分黄酮等。与碱式醋酸铅产生不溶性铅盐或络合物的范围更广。 试剂沉淀法在生物碱盐的溶液中，加入某些生物碱沉淀试剂（见生物碱性质下），则生物碱生成不溶性复盐而析出。 水溶性生物碱难以用萃取法提取分出，常加入雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀析出用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质； 胆甾醇也常用以沉淀洋地黄皂甙等。2.1.5盐析法盐析法是在中草药的水提液中、加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可

11、使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。 盐析用的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。三七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态， 三七皂甙乙即可沉淀析出， 自黄藤中提取掌叶防己碱， 自三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸铵盐析制备。有些成分如原白头翁素、 麻黄碱、苦参碱等水溶性较大， 在提取时， 亦往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂萃取。2.2 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离分配系数（ K） 两种相互不能任意混溶的溶剂（如氯仿与水）如置分液漏斗中充分振摇， 放置后即可分成两相。 此时如果其中含有溶质， 则溶质在两相溶剂中的分配比（ K）在一

12、定温度及压力下为一常数，可以下式表示：K=CU/CL K：分配系数； CU：溶质在上相溶剂中的浓度；CL：溶质在下相溶剂中的浓度。1、液-液萃取法2、逆流连续萃取法3、逆流分配法（ CCD）4、液滴逆流色谱法（ DCCC）5、高速逆流色谱法（ HSCCC）6、气液分配色谱（ GC 或 GLC）7、液-液分配色谱（ LC 或 LLC ）2.2.1液-液萃取法利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。萃取时如果各成分的分配系数相差越大，分离效率越高。 水提取液中的有效成分是亲脂性的物质， 一般多用亲脂性有机溶剂， 如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取；有效成分是偏于亲水性的物

13、质，需用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。提取黄酮类成分多用乙酸乙脂和水的两相萃取。提取亲水性强的皂甙则多选用正丁醇、异戊醇和水作两相萃取。液-液萃取法操作注意事项： 先用小试管猛烈振摇约1 分钟，观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇，可延长萃取时间。如碰到乳化现象，可将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤，或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转， 令其自然分层。 乳化现象较严重时， 可以采用二相溶剂逆流连续萃取装置。 水提取液的浓度最好在比重1.11.2 之间，过稀则溶剂用量太大，影响操作。2.2.2高速逆流色谱(High-speed Coun

14、tercurrent Chromatography ，HSCCC) 大多数色谱法都需要有固相载体某种形式的选择性吸附作用。在应用固相载体色谱分离中， 往往会存在不同程度的不可逆吸附，造成被分离样品的损失， 尤其在分离微量样品时受到限制。高速逆流色谱， 是近十年迅速发展起来的新型液液分配色谱技术。 与其它液相色谱分离方法相比 它不使用固相载体作固定相， 被分离物质在互不相溶两相分配分离，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。且花费溶剂少，分辨率高，可进行纯品制备。利用HSCCC，中草药粗提物的分离纯化制备可同步完成，被分离物可定量回收。 HSCCC 的工作原理两种互不相溶的溶

15、剂在聚四氟乙烯管内作高速行星运转，其中一相溶剂作固定相，用恒流泵输送载有样品的另一相溶剂穿过固定相，两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配能力不同，导致在聚四氟乙烯管中移动的速度也不同，从而使样品中各组分得到分离。 HSCCC 的特点1、 应用范围广，适应性好由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多，因而 HSCCC 适用于任何 极性范围的品的分离，特别适用于分离极性大的组分以及一些生物大分子。2、 操作简便，容易掌握对样品的预处理要求低，一般的粗提物即可进行HSCCC 的制备分离或分析。3、回收率高固定相为液体，无需固体作载体，克服气、液相色谱使用固相

16、载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。4、重现性好分离过程稳定、峰的保留相对标准偏差小于2，5、分离效率高，分离量较大与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，特别适用于制备性分离，产品纯度高，制备量大，溶剂消耗少。较大的制备型 HSCCC，柱容积可达 530ml，一次最多进样可达20g 粗品；较小的分析型的 HSCCC 柱容积为 8mL，进样量为几十微克，最大转速可达4000rmin.因此，被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究。 HSCCC 的应用根据以上特点， HSCCC 适合于中药成分的分离和分析。目前高速逆流色谱仪已成功地开发出分析型和制备型两大系列。制备或半制备 HSCCC 的特点是高流速、高浓度，不但适用于非极性化合物的分离，也适用于 极性化合物的分离。在制备分离方面， 可用于中药粗提物中各组分的分离，也可进一步精制， 甚至直接从从粗提物 步纯化到纯品，来制备中药化学成分标准品。HSCCC 的分离效率与气相色谱和高效液相色谱等技术相比较，前者不适宜用它完成组成