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1、,基因重组与基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering,第 一 节 重组DNA技术,DNA Recombination Technique,一、相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 二、基本原理及操作步骤,本节主要内容,一、重组DNA技术相关概念,克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（一） DNA克隆,DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化
2、或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。,生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。,目的 分离获得某一目的基因或DNA 获得目的基因的表达产物（蛋白质）,基因工程(genetic engineering) 实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重组DNA技术。,（二）工具酶,限制性核酸内切酶DNA聚合酶逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease)
3、识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。,+,Bam H,作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA， 保护自身DNA。,分类： 、类 （基因工程技术中常用的是类）,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,Hin d,属 系 株 序,Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点： 回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切
4、口,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,DNA聚合酶和DNA连接酶,DNA连接酶催化5和3端形成磷酸二酯键，底物为带缺口的DNA、黏端DNA或平端DNA。,+,Bam H,（三）目的基因,cDNA (complementary DNA)：为具有与某RNA链呈互补的碱基序列的单链DNA 基因组DNA (genomic DNA),（四）基因载体,定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。,常用载体 质粒DNA 噬
5、菌体DNA 病毒DNA,克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。,载体的选择标准,含有复制起始点，能在宿主中独立复制； 分子量小，以容纳较大的外源DNA； 不能插入宿主基因组，易于分离和纯化； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），由限制性内切酶的识别序列组成。,1. 质粒 (plasmid),特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗
6、传性状（一般带有抗生素的抗性基因）。,细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。,噬菌体DNA改造系统 gt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）,2. 噬菌体(phage) ：适用于大片段DNA的克隆,M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列,3. 柯斯质粒(cosmid),pJB8的物理图谱,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC) 动物病毒DNA改造的载体腺病毒载体逆转录病毒载体 杆状病毒载体,其他,二、重组DNA技术基本原理,目的基因的获取,重组DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接
7、,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,以质粒为载体的 DNA克隆过程,（一）目的基因的获取,1. 化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2. 基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),1. 化学合成法,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因片段,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,2. 基因组
8、DNA文库,DNA序列是已知的，或两端已知，可以利用选择性体外扩增DNA的方法PCR。是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。,4. 聚合酶链反应（PCR）,模板DNA 引物 4种dNTP Taq DNA聚合酶 含Mg2+的缓冲液。,PCR的反应体系,（1）变性，加热至95 ，使模板DNA解开成单链； （2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合； （3）延伸，温度升至72 ，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3-OH上，合成与模板互补的DNA新链。,PCR的基本反应步骤及原理,PCR反应条件,变性 95C,延伸 72C,退
9、火 Tm-5C,Tm指的是把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度,PCR反应的基本原理,（三）外源基因与载体的连接,1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接,（二）克隆载体的选择和构建,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶 15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2. 平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端,3. 同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制
10、造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,5 3,3 5,5 3,3 5,53 A(A)nA,A(A)nA 3 5,-核酸外切酶,-核酸外切酶,末端转移酶 + dATP,末端转移酶 + dTTP,4. 人工接头(linker)连接由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,CCGAATTCG GGCTTAAGC,5- 3-,Eco R,受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent),导入方式 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染
11、(infection),（四）重组DNA导入受体菌,（五）重组体的筛选1. 直接选择法(1) 抗药性标记选择(2) 标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹2. 免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等,(插入失活法) 抗药性标记选择,组氨酸缺陷 型大肠杆菌,无组氨酸 的培养基,酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救, 互补的检测,重组DNA技术操作过程可形象归纳为,小 结,重组DNA技术操作的主要步骤,表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,1. 原核表达体系 （
12、E.coli表达体系最为常用） 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、费钱,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射,2. 真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,表达载体pFASTBACI 的物理图谱,（一）疾病基因的发现与克隆
13、 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,三、重组技术与医学的关系,（二）生物制药,重组DNA医药产品,基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（三）基因诊断,基本过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,标准 . 能正确扩增靶基因； . 能准确区分单个碱基的差别； . 本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定; . 便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,（四）基因治疗,定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy),1. 产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性,（五）遗传疾病的预防,复习思考题：1. 概念：（1）克隆 （2）转化（3）转位 （4）基因工程（5）转座 （6）限制性核酸内切酶（7）载体 （8）质粒2. 简述基因工程的基本过程。3. 简述目的基因的主要来源或途径。,
