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1、DNA Barcoding在药用植物 鉴定中的应用,DNA Barcoding in the identificationof medicinal plants,刘 滨 李宏富,DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段(DNA barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统,它可以对物种进行快速的自动鉴定。 DNA Barcoding的概念由加拿大动物学家Paul Hebert首次提出。,Paul Hebert等对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13 320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶亚
2、基1（Cytochrome coxdase I，CO I）基因序列比较分析，除腔肠动物Cnidaria外，98%的物种遗传距离差异在种内0%-2%，种间平均可达到11.3%，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种；他们将超市用以区分成千上万种不同商品的条形码概念引入，把这种小片段基因序列称作物种的DNA条形码（DNA barcodes）并提出为全球生物编码的计划。,DNA条形码的原理,DNA是生物的遗传信息载体。遗传基础的不同，决定了生物的多样性。由于每种生物物种的DNA序列都是唯一的，就给DNA条形码提供了物质基础，每个位点上都有A、T、G、C 4种选择。 由于部分碱基的保守性，几十个碱基
3、的长度不能提供足够的编码信息，因此目前的DNA条形码分析都是基于几百个碱基长度的DNA序列。,DNA条形码的标准,Kress等(2005)和Taberlet等(2007)提出了理想的DNA条形码标准： (1)具有可以区分物种的足够变异和分化，同时种内变异必须足够小； (2)有高度保守的引物设计区以便于设计通用引物； (3)片段足够短，以便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对部分降解的DNA的扩增。,DNA条形码的优点,生命条形码联盟(consortium for the barcode oflife, CBOL)阐述了DNA条形码的优点： (1)以DNA序列为检测对象，其在个体发育过程中不会改变
4、。同种生物不同生长时期的DNA序列信息是相同的，即使经过加工，形态发生变化，而DNA序列信息不会改变，较之传统的方法，扩大了检测样本范围；同时样本部分受损也不会影响识别结果。 (2)可进行非专家物种鉴定。该技术是可机械重复的，只要设计一套简单的实验方案，经过简单培训的技术员即可操作。,DNA条形码的优点,(3)准确性高。特定的物种具有特定的DNA序列信息，而形态学鉴别特征会因趋同和变异导致物种的鉴定误差 (4)通过建立DNA条形码数据库，可一次性快速鉴定大量样本。分类学家新的研究成果将不断地加入数据库，成为永久性资料，从而推动分类学科更加快速深入地发展。,操作及分析方法,1.提取目的基因 2.
5、PCR 3.电泳 4.结果分析,植物DNA的提取,1.2g新鲜植物叶片，液氮中研磨尽量越细越好； 2.至50ml离心管中，加8ml细胞提取液，混匀，65水浴保温20min； 3.取出离心管，加入2.5ml 5mol/L KCl溶液，混匀，冰浴20min； 4.4000r/min20min，并转移上清至另一50ml离心管； 5.加等体积酚/氯仿混匀，12000r/min5min，取上清；,6.加等体积氯仿，混匀，12000r/min5min，取上清； 7.加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀 8.离心获得沉淀，70%乙醇洗3次。干燥沉淀（不要太干，否则DNA不易溶解）。 9.加入20
6、0L TE缓冲液，溶解DNA； 10.上清液就是所需的目的基因DNA。参考：分子生物学实验指导（第二版）高等教育出版社 主编：魏群,聚合酶链式反应（PCR）,1.PCR技术的创建 2.PCR的原理 3.PCR的反应体系和方法 4.PCR技术的近现代运用,基因组DNA,引物,DNA聚合酶,DNA片段体外扩增,PCR技术的创建,Kary B. Mullis（穆利斯（美）,Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Ta
7、q）引入了PCR技术 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,Kary B. Mullis（1944）,http:/,三篇重要论文,The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction (Scientific American, 1990,262(4):56-61, 64-5 )Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase (S
8、cience,1988,239(4839):487-91 ) Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction (Methods in Enzymology, 1987,155:335-50 ),生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,PCR技术诞生所依赖的社会需求和研究需要,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,1983年,94变性,50-65退火,XX延伸,94,55,37
9、,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,10080604020,1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术,72,94,55,PCR循环,TaqDNA聚合酶的发现，使整个PCR过程更加的简单化，让整个反应省事、省力、省财。 不用在关键环节（变性-褪火-延伸重复）不断的加入反应底物。,PCR技术的原理,1 PCR技术的基本原理,无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延
10、伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。,PCR扩增原理,引物,延伸,延伸,5,5,3,3,变性、退火,变性、退火,2 PCR技术的特点,1 ）高度的灵敏性,30轮循环,扩增量达230个拷贝（109拷贝）,PCR产物每轮循环增加一倍,2 ）特异性,引物,引物
11、,引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计原则： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,3）操作简便易行,PCR扩增法,只需要数小时,就可以用电泳法检出1g基因组DNA中仅含数个拷贝的模板序列。通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入
12、细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;这种方法,要经过DNA内切、连接、转化和培养等相关的过程,操作复杂,一般需要数周时间。,PCR的反应体系和方法,PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。,总体积 50-100 lBuf
13、fer 缓冲液dNTP 原料Primer 引物DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶,1 反应体系,PCR技术的基本过程(1),模板DNA dNTP 引物 Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物 Buffer,TaqDNA聚合酶,94oC5,2 基本过程,PCR技术的基本过程(2),Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,循环仪,94 55 72 ,Taq 酶 模板DNA dNTP 引物 Buffer,72 57 min,循环2535次,PCR技术的基本过程(3),1）PCR反应成分,（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合
14、蛋白类。一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,3 PCR反应条件,（2）引物浓度0.1-0.5 mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)0.5-2.5 U/50 l酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol
15、/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,（3）延伸70-75,一般为72延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加,经典循环参数（500bp以内）,94 30s 55 45s 72 1min,94 5min,30次,72 7min,42 forever,全新4通道实时荧光定量PCR仪,普通梯度PCR仪,PCR技术的应用,1) 基因克隆,基因工程产品,5,5,Bam H I,
