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1、基因工程 Genetic Engineering,主讲教师：李黄金 http:/ Email: 任课教师：张文峰、陈伟 生命科学与生物制药学院 13,基因工程课程内容,5,2,3,4,1,6,7,基因工程概论,分子克隆单元操作,大肠杆菌基因工程,酵母基因工程,动物基因工程,植物基因工程,基因工程进展,回顾：基因工程的基本目的是什么？,1、获取、整理遗传信息资源： 破解生命之谜、利用基因资源 2、生产功能蛋白或化学原料研究用途：基因功能研究，工具酶、免疫分析用抗原/抗体医药用途：蛋白/多肽药物、抗原（疫苗）、抗体（治疗/诊断）、免疫毒素等。 工业用途：工业用酶、工业原料 3、改良生物性状：分子
2、育种（改良/创造）、基因治疗/免疫,问题：如何利用基因资源？,克隆目的基因,转入特定宿主,表达目的基因,生产蛋白/多肽：强调高效 分子育种/基因治疗/免疫：强调可控,全基因：基因文库/PCR 编码序列：cDNA文库/RT-PCR/合成,选择宿主（特点、优缺点？） 构建表达载体（关键元件、调控原理？） 转基因（转化系统、导入方法？）,基因工程主要宿主系统,原核细胞(Prokaryotic),真菌（Fungus ),昆虫(Baculovirus ),高等真核细胞（Eukaryotic),人（基因治疗）,动、植物（基因农场）,主要的蛋白质生产宿主系统,I 原核：大肠杆菌Escherichia col
3、i *枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis *,II 低等真核： 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 毕赤酵母Pichia pastoris *汉森酵母Hansenula polymopha *黑曲霉菌Aspergillus niger *,III 高等真核：中国仓鼠细胞（CHO） *昆虫细胞杆状病毒*,重点：各自优缺点是什么？,表达载体的基本条件（关键元件）,1、高效的、可调控的表达元件1）转录与转录后水平：DNA mRNA 原核：启动子、终止子 真核：启动子、终止子、增强子、PolyA位点、内含子2） 翻译水平 原核：核糖体结合位点（如SD序列） 真核：5-
4、端非翻译区（5-UTR）3) 翻译后水平: 信号肽,重点：各宿主系统表达载体 的关键元件、调控原理与 优化策略？,表达载体的基本条件（关键元件）,3、便于筛选大肠杆菌中的筛选标记（表达载体构建）最终宿主系统的筛选标记（转基因宿主筛选） 4、便于目的基因亚克隆：多克隆位点,2、高拷贝数与遗传稳定,自主复制（高拷贝、不稳定）整合（低拷贝、稳定）,典型的原核表达载体,典型的原核表达载体,典型的真核表达载体,第三章 大肠杆菌基因工程,Escherichia coli （SEM，14000）,四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化,三、工程菌构建策略,二、大肠杆菌表达系统高效表达原理,一、大肠杆菌表达
5、（生产）系统的优缺点,五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例,第三章 大肠杆菌基因工程,一、 大肠杆菌表达系统的优缺点,原核细胞与真核细胞的差别,生长速度惊人的大肠杆菌,遗传背景清楚（4405个ORF），便于基因操作,表达水平高，遗传较稳定,优良的工业性能：繁殖迅速、培养简单、操作方便、,被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统,大肠杆菌表达系统的优点,胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵体），分泌机制不完善,缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖基化蛋白、结构复杂的蛋白等）,细胞周质内含有种类繁多的内毒素,大肠杆菌表达系统的缺点,初次尝试扫盲乱棍打枣入门系统优化中级自成一体高手,成功的实验都是
6、一样的，失败的实验各有各的不幸,二、大肠杆菌系统高效表达原理,启动子（转录）,终止子（转录）,核糖体结合位点（翻译）,密码子（翻译）,质粒拷贝数（转录）,大肠杆菌系统表达载体的基本元件,A、目的基因：编码外源蛋白的结构基因 B、转录元件：启动子、终止子 C、翻译元件：核糖体结合位点、翻译起始位点 D、克隆元件：克隆位点、复制原点、标记基因 E、翻译后元件（非必须） ：信号肽、融合肽,大肠杆菌系统表达载体的物理图谱,1、启动子与外源基因表达,*是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始RNA合成的序列。 *是基因表达最关键调控元件（没有启动子，基因就不能转录）。 *启动子有种属特异性（如真核的
7、在原核宿主中无效） *有组成型和诱导型二大类,启动子 (Promoter),组成型与诱导型启动子,*无需诱导 *整个生长过程一直不停地表达目的蛋白 *一般采用基础代谢关键酶基因的启动子 *不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白产物 *表达量通常不高：过量或者有害表达影响细菌生长,组成型表达系统,组成型与诱导型启动子,*只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物 *使生长相与表达相分开，避免表达与生长争营养和对菌体的毒害 *可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解 *特别适合解决有毒蛋白的表达 *启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。,诱导型表达系统,原核基因启动子,
8、原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成： （1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游510bp，一般由68个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或10区。 （2）35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称35区，一般由10个碱基组成。,启动子保守序列,-35 区序列,-10 区序列,PlL,PrecA,Ptrp,Plac,PtraA,Ptac,启动子,T T G A C A,G A T A C T,T T G A T A,T A T A A T,T T G A C A,T T A A C T,T A G A C A,T A A T G T,T T T A C A,T
9、 A T A A T,T T G A C A,T A T A A T,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,启动子的筛选,Apr,ori,galK,pKO1,终止子,采用鸟枪法策略，将合适大小的DNA片段,克隆到启动子探针质粒pKO1上,宿主细胞染色体DNA上的galE、galT与质,粒上报告基因galk的表达产物联合作用，,可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质,转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株,含有外源启动子活性的重组克隆,常用原核基因启动子,lac (乳糖启动子) trp (色氨酸启动子) tac（乳糖和色氨
10、酸的杂合启动子 PL和PR(噬菌体的左向和右向启动子) T7启动子,启动子,P,乳糖启动子（Plac） 负调控（lacI）：,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,基底水平转录,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,P,乳糖启动子Plac,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,基底水平转录,底水平表达；
11、诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,lacI 负调控,转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控,P,乳糖启动子Plac,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,基底水平转录,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控,lacI 负调控,P,乳糖启动子Plac,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在
12、一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,高水平转录,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控,lacI 负调控,P,乳糖启动子Plac,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,底水平表达；诱导物可以使,启动子Plac介导的转录大幅,提高,转录受 CAP 正调控和 lacI 负调控,lacI 负调控,问题1： 葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏， 不便于发酵培养基设计 对策： 采用突变型Plac
13、 UV5（不受葡萄糖阻遏）,Plac -lacI 调控模式的问题与策略,Plac,CAP正调控,O,Plac,O,高效转录,葡萄糖代谢,野生型的Plac上游附近拥有,代谢激活蛋白（CAP）结合,区，cAMP激活CAP，CAP,基底水平转录,结合启动子控制区，进而促,进Plac介导的转录。葡萄糖,代谢使cAMP减少，也能阻,遏Plac介导的转录。因此，,可采用突变手段构建抗葡萄糖代谢阻遏的,突变型，,即Plac UV5,CAP,cAMP,cAMP浓度降低,Plac UV5,O,高效转录,突变型乳糖启动子Plac UV5,问题2 乳糖容易被宿主菌利用和降解，不宜作为诱导剂对策 采用“安慰诱导剂”I
14、PTG（不被降解和代谢）,Plac -lacI 调控模式的问题与策略,IPTG：异丙基 D-硫代半乳糖苷 (isopropyl-D- thio galactoside),问题3： 宿主lacI 阻遏蛋白表达量不高，无法满足多拷贝质粒的需求， 导致较高的本底表达（即无诱导表达）对策 A、采用能过量表达 lacI 阻遏蛋白的 lacI q 突变菌株B、在 载体上引入 lacI q 基因,Plac -lacI 调控模式的问题与策略,启动子,Ptrp,色氨酸启动子（Ptrp）,Otrp,除去色氨酸,色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏,蛋白复合物的阻遏，转录呈基底,状态。在培养系统中去除色氨酸,基底水平
15、转录,或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），,便可有效地解除阻遏抑制作用。,在正常的细菌培养体系中，除去,色氨酸是困难的，因此基因工程,中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目,基因的表达,色氨酸,或加3-吲哚丙烯酸,高效转录,阻遏蛋白,（IAA）,Otrp,Ptrp,高效转录,Otrp,Ptrp,受 lacI 阻遏蛋白调控,杂合型启动子Ptac,Ptac = Ptrp 的-35区+ Plac的-10区,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,（T T G A C A）,（T A T A A T）,受什么诱导？,l噬菌体启动子PL / PR,受CI阻遏蛋白阻遏 CI为组成型表达 常采用温度敏感型突变cI857,cI857阻遏蛋在42时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达,实践中，28-37培养， 42诱导。30 /37 ？,发酵罐中大规模升温困难 如何解决？,常使Ptrp控制的CI 用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达（不是加3-吲哚丙烯酸，IAA）。,Ptrp,A,
