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1、微生物课程实习方案 一、样品的采集处理方法 1. 遵循的原则 ：第一，采集的样品要均匀一致、有代表性，能够反映被分析食品 的整体组成、质量和卫生状况；第二，在采样过程中，要设法保持原有的理化指 标，防止成分逸散或带入杂质。 2. 采样的方法 因为本组所进行实验的材料是腐竹，属于无包装的散装样品， 对于无包装的 散堆样品，其取样方法如下： 一般按三层五点法进行代表性取样。首先根据一个检验单位的物料面积大 小先划分若干个方块，每块为一区，每区面积不超过50cm2 。每区按上、中、 下分三层，每层设中心、四角共五个点。按区按点，先上后下用取样器各取少量 样品；再按四分法处理取得平均样品。 二、预计时
2、间安排 1.2011/12/16 12/18: 查阅资料，写好实验方案 2.2011/12/19 ：给老师检查实验方案，并进行修改。领取实验器材，并清洗实验 器材，做好准备工作。 3.2011/12/20 12/25：进行腐竹中酵母菌和霉菌的数目检测实验。 4.2011/12/26 12/30：进行腐竹中细菌的检测实验和大肠杆菌的定性实验 5：预计酵母菌和霉菌大概培养5 天，预计细菌大概培养 3 天，在这期间每天上、 下午定时进行观察，并记录菌落的生长状况。 三、注意事项 1. 细菌的培养在三栋 105 2. 酵母菌的培养在三栋108 3. 每次使用完高压灭菌锅和超净工作台后写明时间，组别（写
3、组长的名字）。 4. 称量样品时必须在 108，即无菌室那边。 5. 每个实验前应该把移液管，试管，三角瓶，以及培养皿洗好并灭菌。 腐竹中酵母菌数目检测 一. 实验目的 采取分离培养方法检测腐竹中细菌数目。 二. 实验器材 研钵一个， 500mL量筒 1 个，滴定管 1 根，1 mL吸管 4 根，试管 4 根，玻璃 棒 2 根，培养皿 12 个，500mL烧杯一个，涂抹棒1 根，洗耳球 1 个，牛角匙 2 个，瓷杯 1 个，漏斗，橡皮管，铁夹1 套，铁架台 1 个，电磁炉 1 个，天平 1 台，pH试纸，250mL三角烧瓶 3 个，标签纸 2 张，纱布，棉花，棉线若干，高压 蒸汽灭菌锅一台，恒
4、温培养一台，超净工作台。 三. 实验药品 马铃薯，葡萄糖，琼脂 四. 检验程序 注：采用涂抹平板计数法 先在每一灭菌平皿倾注15mL左右固体培养基，制成平板，做好标记，每个稀释 度做 3 个平行，然后用无菌吸管吸取0.2mL 样品稀释液对号接种在不同稀释度的 琼脂培养皿上，然后分别用无菌玻璃涂布棒将稀释液涂布均匀，平放桌上20-30 分钟，使稀释液渗透于培养基中，然后将培养基倒置，28培养， 3 天后计数。 注：在酵母菌的培养期间， 安排组员每天上、 下午定期来进行观察菌落的生长情 况，并详细记录好每次观察到的现象。 五. 实验步骤 1、 样品的预处理及稀释 1.1 、 固体和半固体样品：以无
5、菌操作取25g 样品，置盛有 225 mL 无菌水的 无菌研钵内，再转移至500ml 烧杯中，充分振摇，即制成1:10 的样品匀液。 1.2 、 样品匀液的 pH 值应在 6.5 7.5 之间，必要时分别用1mol/L NaOH或 1mol/L HCI 调节。 1.3 、 用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液 1mL ，沿管壁徐徐 注人盛有 9 mL无菌水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）， 振摇试管或换用 1 支 1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 1.4 、 按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品匀液。每递增稀释1
6、次，换 用 1 支 1mL无菌吸管或吸头。 从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 min 。 1.5 、根据对样品污染状况的估计，选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液 （液体样品可包括原液），【根据对腐竹的污染情况估计可选取10-2、10-3、 10-4 三个稀释度】在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿 内，每个稀释度做3 个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平 皿内作空白对照。 （注：每个稀释度做三个平皿的好处在于有利于排除错误的平 皿，单数量的平皿也有利于选取中间菌落数，防止一大一小是不好取舍，使得 数据更加准确 ） 1.6 、 及时将
7、 15 mL20 mL 冷却至 46 的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（可放 置于 46 1 恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 2、培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养 5d，观察并记录。 3、 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌。以菌落形 成单位（ colonyorming units，CFU ）表示。 选取菌落数在10 CFU 150 CFU 的平板，根据菌落形态计数酵母菌，为白 色菌落、比细菌菌落大几倍到几十倍。菌落数应采用两个平板的平均数。 4、结果与报告 （1） 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 （2）若所有
8、平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数， 其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 （3）若所有平板上菌落数均小于10 CFU ，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以 稀释倍数计算。 （4） 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算； 如为原液，则以小于1 计数。 六. 培养基的制备 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA ） 配方：欲配制 500ml 的培养基 马铃薯 150g、葡萄糖（或蔗糖） 10g、琼脂 10g、H2O 500 mL 、pH 6.5 。 PDA培养基配制方法 马铃薯（去皮、去芽眼）切成片（玉米大小）称取150g5
9、00mL H2O 煮沸 15-20min 双层纱布过滤取滤液并补足500mL 琼脂熔化其它营养物质 调节 pH （用 HCl 或 NaOH ）分装试管塞上棉塞捆扎灭菌（高压蒸气灭 菌 15-30min）制成斜面检查灭菌效果（即2830培养 23d） 七. 实验记录 稀释度 1 稀释度2 稀释度 3 培养皿 1 培养皿 2 培养皿 3 平均菌落数（个） 预计5天完成 腐竹中霉菌数目检测 一. 实验目的 采取分离培养方法检测腐竹中细菌数目。 二. 实验器材 研钵一个， 500mL量筒 1 个，滴定管 1根，1 mL吸管 4 根，试管 4 根，玻璃棒 2 根，培养皿 12 个，500mL烧杯一个，涂
10、抹棒1 根，洗耳球 1 个，牛角匙 2 个， 瓷杯 1 个，漏斗，橡皮管，铁夹1 套，铁架台 1 个，电磁炉 1 个，天平 1 台，pH 试纸，250mL三角烧瓶 3 个，标签纸 2 张，纱布，棉花，棉线若干，高压蒸汽灭 菌锅一台，恒温培养一台，超净工作台。 三. 实验药品 孟加拉红培养基，琼脂 五. 检验程序 注：在霉菌的培养期间， 安排组员每天上、 下午定期来进行观察菌落的生长情况， 并详细记录好每次观察到的现象。 五. 实验步骤 1、 样品的预处理及稀释 1.1 、 固体和半固体样品：以无菌操作取25g 样品，置盛有 225 mL 无菌水的 无菌研钵内，再转移至500ml 烧杯中，充分振
11、摇，即制成1:10 的样品匀液。 1.2 、 样品匀液的 pH 值应在 6.5 7.5 之间，必要时分别用1mol/L NaOH或 1mol/L HCI 调节。 1.3 、 用 1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液 1mL ，沿管壁徐徐 注人盛有 9 mL无菌水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面）， 振摇试管或换用 1 支 1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 1.4 、 按上述操作，依次制成10 倍递增系列样品匀液。每递增稀释1 次，换 用 1 支 1mL无菌吸管或吸头。 从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 15 mi
12、n 。 1.5 、根据对样品污染状况的估计，选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液 （液体样品可包括原液），【根据对腐竹的污染情况估计可选取10-2、10-3、 10-4 三个稀释度】在进行10 倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿 内，每个稀释度做3 个平皿。同时，分别吸取1 mL 空白稀释液加入两个无菌平 皿内作空白对照。 （注：每个稀释度做三个平皿的好处在于有利于排除错误的平 皿，单数量的平皿也有利于选取中间菌落数，防止一大一小是不好取舍，使得 数据更加准确 ） 1.6 、 及时将 15 mL 20 mL 冷却至 46 的孟加拉红培养基（可放置于46 1 恒温水浴箱中保温）倾注平
13、皿，并转动平皿使其混合均匀。 2、培养 待琼脂凝固后，将平板倒置，281培养 5d，观察并记录。 七. 菌落计数 肉眼观察，必要时可用放大镜， 记录各稀释倍数和相应的霉菌。以菌落形成 单位（ colonyorming units，CFU ）表示。 选取菌落数在10 CFU 150 CFU 的平板，根据菌落形态计数霉菌，霉菌多 为绒毛状、絮状、蜘蛛网状乳白色、少数为红色、为灰色菌落，有黑色孢子。 霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均 数。 4、 结果与报告 （1） 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 （2）若所有平板上菌落数均大于150
14、 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数， 其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 （3）若所有平板上菌落数均小于10 CFU ，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以 稀释倍数计算。 （4） 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算； 如为原液，则以小于1 计数。 六. 培养基的制备 孟加拉红培养基 配方：欲配制 500ml 的培养基 成分：蛋白胨 2.5g葡萄糖 5g磷酸二氢钾 0.5g硫酸镁 (MgSO4 7H2O) 0.25g琼脂 10g 1/3000孟加拉红溶液 50mL蒸馏水 500mL氯霉素 0.05g 制法：上述各成分加入蒸馏水中溶解后，
15、再加孟加拉红溶液。 另用少量乙醇溶解 氯霉素，加入培养基中，分装后， 121灭菌 20min。 八. 实验记录 稀 释 度 平板一 平板二 平板三 平均菌数（个 /g ） 样品中霉菌的含量（个 /g ）: 预计 5 天完成 腐竹中细菌数目检测 一. 实验目的 采取分离培养方法检测腐竹中细菌数目。 二. 实验器材 研钵一个， 500mL量筒 1 个，滴定管 1 根，1 mL吸管 4 根，试管 4 根，玻璃 棒 2 根，培养皿 12 个，500mL烧杯一个，涂抹棒1 根，洗耳球 1 个，牛角匙 2 个，瓷杯 1 个，漏斗，橡皮管，铁夹1 套，铁架台 1 个，电磁炉 1 个，天平 1 台，pH试纸，
16、250mL三角烧瓶 3 个，标签纸 2 张，纱布，棉花，棉线若干，高压 蒸汽灭菌锅一台，恒温培养一台，超净工作台。 三. 实验药品 牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂 四. 检验程序 检 样 25g （mL ）样品 + 225mL 无菌蒸馏水，均质 10 倍系列稀释 选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液，各取 1.0mL 分别加入无菌培养皿中 3724-48h 计数菌落总数 报 告 注：在细菌的培养期间， 安排组员每天上、 下午定期来进行观察菌落的生长情况， 并详细记录好每次观察到的现象。 五. 实验步骤 每皿中加入 15mL20mL 牛肉膏蛋白胨培养基，混匀 培养 计数各平板菌落数 1、 样品的预处理及稀释 1.1 、 固体和半固体样品：以无菌操作取25g 样品，置盛有 225 mL 无菌水的 无菌研钵内，再转移至500ml 烧杯中，充分振摇，即制成1:10 的样品匀液。 1.2 、 样品匀液的 pH 值应在 6.5 7.5 之间，必要时分
