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1、病原微生物实验笔试（操作，示教内容）：题型： 1、名解（ 2 个 x10）2、填空（ 25 个 x2）3、论述（ 30 分）复习：1.2：常用仪器的使用1、高压蒸汽灭菌：最常用，最有效的一种湿热灭菌法，通过密闭的高压蒸汽灭菌器，是容器内压力调至103.4kPa，温度达到121.3，维持20min-30min ，能杀死包括芽孢在内的所有微生物。适用于包括液体在内的各种耐热、耐潮湿物品的灭菌。1.1.3：常用试剂的配置1、双糖铁培养基：乳糖：G=10:1，若细菌能分解两种糖，因产酸量多，整个培养基由红变 黄；若细菌只能分解G，因产酸量少、斜面表面积大，有机酸易挥发氧化，结果为培养基底部变黄，斜面仍
2、保持红色。该培养基中还含有亚铁离子，可与硫化氢生成黑色沉淀，故还能观察到某些细菌分解含硫氨基酸产生硫化氢的情况。本培养基主要用于肠道致病菌的鉴定。2、S-S 琼脂培养基：培养基的选择作 用体现在煌绿对球菌生长有抑制作用，有助于肠道致病菌的生长； 胆盐、 枸橼酸钠、 硫代硫酸钠可抑制革兰阳性细菌和大多数的大肠埃希菌属细菌的生长； 枸橼酸铁能中和中性红的毒性作用，并能与硫代硫酸钠作为还原剂，避免某些细菌产生的硫化氢被氧化。培养基的鉴别作用 体现在不发酵乳糖的沙门菌属和志贺菌属细菌，在平板上形成的菌落不着色，呈半透明。大肠埃希菌能发酵乳糖，产生的算是胆盐沉淀，胆盐与中性红结合后，是菌落成红色， 在平
3、板上可见培养基中红色成片的乳浊状沉淀。某些变形杆菌和沙门菌还能分解含硫氨基酸产生硫化氢，使菌落中心呈黑色。另外， 细菌在其上分解蛋白质产生氨气等碱性代谢产物，使培养基pH 升高，培养基由红变黄。3、沙保弱培养基：主要用于真菌的分离 培养。2.1.1：普通光学显微镜的使用及保护1、显微镜的使用2.2.2：活菌运动的观察1、鞭毛是细菌的运动器官，许多杆菌和弧菌有鞭毛，而球菌一般无鞭毛。有鞭毛的细菌可在液体培养基中做定向运动，起到趋利避害的作用。因此， 有鞭毛的活菌在显微镜下可呈活泼有方向的运动，无鞭毛的细菌则呈不规则的布朗运动。有穿刺法、压滴法和悬滴法。2.2.4：细菌的革兰染色法1、革兰染色：原
4、理（细胞壁学说为重点）（3 分） ，步骤（ 4 分） ，结果（ 2 分） ，意义（ 1分）原理： G+菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖含量高且交联度大，脂质含量少，乙醇脱色过程中，虽然能溶解细胞壁的脂质而在壁上形成小孔，但脱水作用使细胞壁收缩构成屏障，通透性降低，组织细胞内的结晶紫-碘复合物一处，细胞仍保留结晶紫初染的紫色。而G-菌细胞壁结构较为疏松，肽聚糖层较薄， 厚厚的外膜含有丰富的脂质，具有良好脂溶作用的乙醇溶解脂质，细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫-碘复合物溢出，细菌脱色，经复染后即呈红色。步骤：涂片（ 1 滴生理盐水，涂开） 、干燥（自然干燥） 、固定（来回通过火焰三次）；染色（结晶紫初
5、染，1 分钟；碘液媒染，1 分钟； 95%乙醇脱色，半分钟；复红复染，1 分钟）及镜检（油镜下观察结果）。意义：可以观察细菌的形态大小、排列方式等，还可以根据染色结果将所有的细菌区分为G+和 G-菌，有助于鉴别细菌，并未分析细菌的致病性和选用抗菌药物提供依据。2.2.5：细菌的抗酸染色法1、抗酸染色是细菌着色后不被盐酸乙醇脱色的染色方法，主要用于鉴定细菌的抗酸性。抗酸性阳性菌的细胞壁脂质含量丰富，一般不易着色， 通过加热或延长染色时间促使苯酚复红渗透使其着色后，分枝菌酸即表现出抵抗盐酸乙醇脱色的能力，孤军踢被染成红色。而其他非抗菌酸被本分复红着色后，易被盐酸乙醇脱色，最后被亚甲蓝染成蓝色。2、
6、步骤：先用无菌棉签沾痰液标本，直接在清洁载玻片中央涂成菌膜，自然干燥后，火焰固定；滴加苯酚复红液与图片上，之酒精灯火焰上缓缓加热，至有蒸气冒出，维持5min,冷却后， 用流水漂去多余染液； 滴加 3%盐酸乙醇脱色液于菌膜表面，轻轻晃动涂片保持30-60s，直至标本最厚出无红色脱出为止，用流水轻轻洗净脱色液；滴加碱性亚甲蓝液复染1min，用流水轻轻洗净复染液；用吸水纸轻轻吸干载玻片表面的水滴，待标本干燥后于油镜下观察结果。2.3.9：基础培养基的制备1、培养基：由适合于细菌生长繁殖所需的多种营养物质配制而成的基质（4 分） 。合格的培养基，需要具有充足的营养，一定的酸碱度，且清亮无菌（6 分）
7、。2、培养基类型凝固剂添加主要用途液体培养基未添加快速增菌培养，细菌生长动态观察，细菌生化反应检测固体培养基2%-3%琼脂平板可用于细菌的分离纯化、鉴定、计数及药物敏感试验，斜面可用于菌种的短期保存半固体培养基0.5%-0.8%琼脂细菌动力学观察，菌种的保存，细菌生化反应的检测。2.3.10：细菌接种法和生长现象观察1、通过在平板表面划线，培养后得到的由单个细菌生长而形成的细菌集团称为菌落。2、无菌操作3、在液体培养基中，细菌可呈现浑浊生长、沉淀生长、菌膜生长三种生长现象。2.3.15：真菌培养方法1、真菌的培养条件有三高三低的特点：高糖、高氧、高湿度、低营养、低温度、低pH 值。3.1.18
8、：细菌的基本形态及特殊结构观察：1、非细胞型：病毒，nm 级原核细胞型：细菌，结构简单，仅有原始核质，um 级真核细胞型：真菌，结构较完善，体积比细菌大得多。2、细菌按其外形主要有球菌、杆菌和螺形菌（包括弧菌和螺菌）。3、细菌的基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质和核质。4、细菌的特殊结构：芽孢：在缺乏营养条件下，胞质浓缩脱水形成，对理化因素有较强抵抗力荚膜：在营养丰富条件下合成分泌至体外的一层粘液性物质，保护细菌抗吞噬，有助于于宿主之间的粘附。鞭毛：运动器官。菌毛：重要粘附结构，中空的性菌毛可作为细菌遗传物质传递的载体。3.2：细菌鉴别常用的生化反应1、糖发酵试验：包括G、乳糖、麦芽糖、甘露醇和
9、蔗糖五种糖。指示剂：溴甲酚紫。用于细菌的鉴别，特别在肠道细菌的鉴别上。37， 18-24h。2、甲基红试验：可以分解G 产生丙酮酸，是培养基PH5.4，使甲基红呈黄色，为阴性。37， 48h 3、V-P 试验：生成红色化合物，阳性；不变色，阴性。37， 48h。4、枸橼酸盐利用实验：指示剂：溴麝香草酚蓝（BTB ） ，绿色。可利用其作为唯一碳源，分解氨盐生成氨，培养基变碱性，绿色蓝色，阳性；不可利用其做唯一碳源，无法生长，绿色不变，阴性。37， 24h。5、靛基质试验：又叫吲哚试验。具有色氨酸酶的细菌能够分解培养基中的色氨酸产生无色的靛基质， 可与对二甲基氨基苯甲醛反应，形成玫瑰吲哚环， 位阳
10、性； 反之， 阴性。37，48h。6、硫化氢生成实验：生成黑色的硫化铅或硫化亚铁，为阳性；反之为阴性。37， 24h。7、色素生成实验：某些细菌在合成代谢过程中可产生并分泌不同颜色的色素，观察色素的生成有利于细菌的鉴别。细菌的色素分为两种类型：脂溶性色素（如金黄色葡萄球菌分泌的金黄色色素）和水溶性色素（如铜绿假单胞菌产生的绿色色素）。3.5.40：细菌鞭毛变异的诱导及观察1、S-R 变异： S 型菌落表面光滑、湿润、边缘整齐，细菌经人工培养多次传代后菌落表面变得粗糙、干燥、边缘不整齐，即由光滑型变为粗糙型，称为S-R 变异。改型变异是由细菌失去LPS 的特异性寡糖重复单位而引起的，变异时不仅细
11、菌的菌落特征发生改变，其理化特征、抗原性、生化反应、毒力等也常发生改变。2、H-O 变异：有周鞭毛的变形杆菌在普通琼脂表面可形成特殊的迁徙生长现象，其菌落形似薄膜，称为H 菌落。若将此菌点种在含0.1%苯酚的培养基上，变形杆菌的鞭毛形成会受到抑制，不再出现迁徙生长现象，只能在点种处形成不向外扩展的单个菌落，称为O 菌落。通常将失去鞭毛的变异称为H-O 变异。3.5.41：细菌耐药性变异的观察1、细菌对某种药物由敏感变成耐药的变异称为耐药性变异。3.6.43/44/45：荚膜致病作用的检测；细菌致病性酶的检测；细菌内毒素的检测1、血浆凝固酶是鉴别葡萄球菌有无致病性的重要标志。2、荚膜具有抗吞噬、
12、抗体液中有害物质损伤的作用，在感染早期有助于细菌突破宿主的防御功能而迅速向周围扩散。3、内毒素是G-菌细胞壁的LPS 组分，由O 特异性多糖、非特异性核心多糖和脂质A 三部分构成，当细菌死亡裂解后才被释放出来。能溶于水，耐高温，是热原质的主要组分。具有广泛的生物学活性，如发热，休克，白细胞反应，DIC 等。4.2.64：化脓性感染的微生物学检测1、临床化脓性感染主要有化脓性球菌引起，G+主要有葡萄球菌，A 群链球菌， 肺炎链球菌，G-主要有脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌等。2、常见化脓性球菌的检查程序直接图片镜检：革兰染色，镜检（形态，大小，排列，染色性）浓汁、痰液咽拭子37 观察生长情况（菌落特征、 溶血性、 色素等）病灶分泌物血琼脂平板18-24h挑选可疑菌落（涂片染色镜检，生化反应，致病性测定， 血清学鉴定， 药物敏感试验）血液脑脊液肉汤增菌培养穿刺液培养生长后直接涂片、染色、镜检4.2.65：消化道感染的微生物学检测1、粪便中有G-的杆菌和弧菌，有G+的杆菌和球菌。粪便中的细菌易厌氧菌为主。2、常见的消化道感染一具有致病基因的大肠埃希菌、痢疾志贺菌和肠道沙门菌的侵袭感染为主，某些弧菌属细菌也可引起消化道感染症状。3、双糖铁培养基：G：乳糖 =1：10，S-S 琼脂培养基（选择鉴别双重功能，主要用于分离肠道致病性沙门菌属和志贺菌属的细菌）。4、消化道病原菌的检查程序
