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1、葛根芩连滴丸的药理毒理研究摘要 葛根黄芩黄连汤是为太阳病误下而致邪热下利的救误之方同时，要把握病位在胃肠，性质属湿热，病机因陷下，治法宜外解如果湿热久积胃肠，菌株孳生，毒侵肌表而热邪不退者，同样适宜另外，时邪趋里内迫于肺而致咳喘证者，服之效果亦佳。关键字 中药滴丸剂、抗菌活性胃肠道刺激、致敏、急性毒性、伤寒论、中药毒性、文献研究正文 “葛根黄茶黄连汤,再加甘草共煎尝 ,邓 陷 阳 明成热痢,清里解表保安康。”歌诀中所说 ,即葛根黄菩黄连汤,简称为葛根等连汤。它是治疗急性腹泻的经典名方 ,其卓越的清热止泻功效,不仅受到历代医家的普遍重视,也为现代临床广泛应用,现已被制成多种剂型的中成药,疗效可靠
2、 ,应用方便。急性腹泻夏季常见,治疗腹泻的药物便是很多家雇的常备药。有 些人一腹泻就赶 紧用止泻药,却不知,同是腹泻,致病机理却各不相同 ,只 有对症下药 ,才能起到治标又治本的效果。脾虚泄泻证是一种以腹泻、体质量下降、畏寒、倦怠等为主要表现的中医病证, 病证范畴较广, 包括西医的慢性腹泻、溃疡性结肠炎、 肠易激性综合征等多种疾病。它的病因和发病机制复杂, 目前尚缺乏治疗效果比较好的西药。经过系统临床观察, 腹泻康具有健脾益气、缓急止痛、 涩肠止泻等作用, 临床缓解治愈率达90%以上 , 因此本文观察它的治疗作用, 为其临床应用提供试验依据。1.试验材料1.1 药物及制剂药品葛根、黄芩、黄连、
3、甘草等。按比例组成复方。制成滴丸。试剂乙醇、硫化钠、生理盐水、2， 4-二硝基氯苯、十六醇、单硬脂酸甘油酯、液体石蜡、羊毛脂、司盘80、尼泊金乙酯、氮酮、二甲基亚砜、氯化钡、硫酸等。1.2 试验仪器电热恒温水浴锅、恒温磁力搅拌器、回流装置、真空冷冻干燥机（SLPHA I-5 ） 、离心机、高压灭菌器、无菌操作台、冰箱、培养皿、蒸发皿。麦氏比浊标准管（取1.175%氯化钡 0.5ml 与 1%硫酸 99.5ml，充分混匀，装于与接种菌液管径相同的试管中）。1.3 试验动物白色兔，体重1500-2000g；昆明系小白鼠，18-22g；白色豚鼠， 200-250g。试验前临床健康检查均正常。1.4
4、菌种及培养基金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌、停乳链球菌、牛棒状杆菌、革兰氏阴性小杆菌 6 种病原菌。由琼脂培养基、营养肉汤培养基、血清琼脂培养基、血清肉汤培养基。2方法步骤2.1 中药滴丸的制备2.2 体外抗菌试验2.2.1 菌液稀释用灭菌的接种环分别挑取血清琼脂斜面保存的无乳链球菌和停乳链球菌少许，接种于血清琼脂培养基中；再分别挑取营养琼脂斜面保存的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、牛棒状杆菌和革兰氏阴性小杆菌少许，接种于营养肉汤中。将接种后的试管置37 摄氏度温箱，培养16-18h，取出接种管分别校正菌液浓度，使其相当于0.5 麦氏比浊标准管，再用营养肉汤将细菌悬液稀释为105 CUF/ml
5、 的含菌量，备用（链球菌用血清肉汤稀释） 。稀释后的菌液应在15min 内接种。2.2.2 体外抗菌活性的测定采用试管二倍稀释法，测定复方中药对六种致病菌的MIC和MBC 。去 8 支灭菌试管，从1-6 管各加 2ml 无菌营养肉汤（链球菌用血清肉汤），然后于第一支试管加入2ml 的复方中药提取液，混匀取出2ml 加入第二支试管中，再重复加入第三支中，以此类推，至第六支试管，充分混合弃去2ml， 1-6 管的中药含量分别为 500、250、125、62.5、31.3、15.7g/l。第八支加药液2ml 做对照。第七支加营养肉汤 2ml 作为空白对照。 1-6 和第八管分别加稀释菌液0.05ml
6、，加完样充分混匀， 置 36-37摄氏度温箱， 培养 16-18 小时后观察结果。凡无浑浊变化的的药物最低稀释浓度即为该测试菌的最低抑菌浓度。再将肉眼观察无细菌生长的所有试管，划线接种于营养琼脂 （链球菌接种血液琼脂） ，置 36-37 摄氏度培养24h 后观察记录，以菌落数不超过5 个的药物最低稀释浓度为该菌的最小杀菌浓度。2.3 急性毒性试验采用 Karber 法计算 LD50 ，来评价复方中药的急性毒性强度。取小鼠，雌雄各半，饲养观察7d 后，试验前禁食10h。在正式试验前，用少量小鼠，设计若干个剂量组作预备试验，每组 2 只， 以 2 倍量递增或递减， 经口染毒， 确定 LD100和
7、LD0 。在预备试验的LD100 和 LD0 之间，设计5 个剂量组，随机分组，每组动物数10 只。各组之间剂量差距按等比级数1.4 设计。染毒后观察7d 小鼠的中毒情况，主要观察指标为小鼠出现中毒的症状、死亡数和死亡时间。表 1 复方中药对6 种致病菌体外抗菌活性表 2 复方中药提取液经口染毒急性毒性试验统计结果组别剂量 (mg/kg) 动物数（ n）死亡数死亡率（ p）存活率（ q）1 3 4 5 5000 7000 9800 13720 19208 10 10 10 10 10 0 1 3 7 10 0 0.1 0.3 0.7 1.0 1.0 0.9 0.7 0.3 0 临床观察与病理解
8、剖检表明，高剂量组小鼠死前表现精神抑郁、拱背，进而兴奋、 全身颤抖、呼吸困难、窒息死亡。解剖肝脏肿大，实质器官淤血、可视黏膜发绀，其他肉眼未见异常。按照化学物质急性毒性剂量分级标准，LD50大于5000mg/kg，属于实际无毒物质，由其制成的滴丸是安全无毒的。2.4 健康 SD 大鼠 70 只, 随机分成 7 组, 即对照组 ,模型组 , 柳氮磺胺吡啶 0.5 g /kg 组 , 葛根芩连丸 0.75 g/kg 组, 葛根芩连滴丸 1.6, 0.8, 0.4 g/kg 剂量组 , 每组 10只, 雌雄各半。 造模 : 参照文献 1方法制备。按20 mL/kg 灌服 200 g/L 番泻叶浸剂
9、, 1 次/d, 连续 7 d。在灌服3 d 后 ,禁食不禁水 32 h,。造模同时每天在给200 g/L 番泻叶浸剂 4 h 后给予相应药物治疗 7 d,第8 天检测相关指标。稀便率(稀便率 =稀便粪粒数 / 总粪粒数 ); 胸腺指数 =胸腺质量 / 体质量、 脾脏指数 =脾脏质量 / 体质量 ; 血清 D- 木糖含量、 淀粉酶活性、 琥珀酸脱氢酶比活性。主要观察指标: 各组大鼠稀便率、胸腺指数、脾脏指数、血清D- 木糖含量、淀粉酶活性、 琥珀酸脱氢酶比活性。统计学分析 : 实验数据由本文作者采用Excel 软件进行统计学分析, 结果以 xs 表示 , 采用 t 检验。各组大鼠一般症状变化造
10、模大鼠第2 天出现腹泻、稀便, 个别可见血便, 伴见精神委靡 , 活性菌种金 葡 萄 球菌无 乳 链 球菌停 乳 链 球菌牛 棒 状 杆菌大肠杆菌G-小杆菌MIC 31.3 62.5 62.5 125 62.5 125 MBC 62.5 62.5 62.5 125 125 125 竖毛 , 拱背 , 食欲差 , 蜷卧少动。 给予药物治疗后, 精神好转 , 食欲增强 , 稀便减少。 正常组大鼠活泼喜动, 皮毛光亮 ,无异常。 2.2.2 各组大鼠稀便率分别记录7 d 给治疗药物后不同时间各组的大鼠干、湿粪便粒数, 计算稀便率。造模大鼠均出现稀便, 模型组最严重, 柳氮磺胺吡啶 0.5 g/kg
11、组、葛根芩连丸 0.75 g/kg 组、葛根芩连滴丸 1.6, 0.8, 0.4 g/kg 剂量组均较模型组明显改善, 其中葛根芩连丸0.5 g/kg 组、葛根芩连滴丸 1.6 g/kg 剂量组效果最显著。结果见表3 表 3 各组大鼠稀便率比较组别124 h 2448 h 4872 h 7296 h对照组0 0 0.01 0 模型组0.55 0.61 0.68 0.76 柳氮磺胺吡啶 0.52 0.55 0.59 0.69 0.5 g/kg 组葛根芩连丸 0.39 0.43 0.42 0.53 0.75 g/kg 组葛根芩连滴丸 0.49 0.46 0.41 0.56 1.6g/kg 组葛根芩
12、连滴丸 0.45 0.46 0.49 0.59 0.8g/kg组葛根芩连滴丸 0.55 0.53 0.52 0.58 0.4g/kg组组别 96-129 h 120-144 h 144-168 h对照组0.01 0 0模型组0.92 0.80 0.73 柳氮磺胺吡啶 0.81 0.74 0.570.5 g/kg 组葛根芩连丸 0.69 0.59 0.410.75 g/kg 组葛根芩连滴丸 0.67 0.51 0.431.6g/kg 组葛根芩连滴丸 0.80 0.67 0.640.8g/kg组葛根芩连滴丸 0.77 0.73 0.660.4g/kg组综上所述 , 腹泻康在一定程度上能保护大鼠肠黏
13、膜, 改善消化吸收和免疫功能, 对脾虚泄泻证具有防治作用。中药在治疗泄泻方面具有标本兼治、毒性小、副反应少等显著的优势 , 具有较突出的开发研究价值, 本实验反映了腹泻康对脾虚泄泻证有明显的防治作用 ,因而值得对其作用机制进一步深入研究。葛根芩连汤配伍抗腹泻药效实验研究目的：通过对葛根芩连汤各配伍与抗腹泻药效之间关系来探讨其配伍规律。方法： 运用正交设计方法, 用墨汁为显色剂 , 小鼠小肠推进率为指标; 用番泻叶造成小鼠腹泻模型, 以腹泻次数为指标, 观察葛根芩连汤各配伍与药效变化之间的关系。结果 : 葛根芩连汤配伍降低小肠推进率的影响中, 以黄连与炙甘草作用为主, 葛根与黄芩能拮抗黄连的作用
14、 , 炙甘草则增强黄连的作用。减少腹泻小鼠 DI , 主要作用药物为黄连, 芩拮抗黄连, 葛根能增加黄芩的作用, 而炙甘草与黄芩黄连配伍后能增强黄连的作用。结论 : 在葛根芩连汤的抗腹泻药中, 其最佳组合为黄连炙甘草。步骤：1 材料与方法1.1 实验材料各配伍组合煎液由第一军医大学中药新药实验室提供, 各配伍煎液中生药量同原方, 煎法相同 , 煎后均浓缩至39 mL , 使各配伍组合中各组成药生药浓度与全方中各相应生药浓度相同。番泻叶煎液狭叶番泻叶 ( Cassia angustifolia Vahl) 的小叶 , 符合 2000 版中国药典规定并加工炮制合格的饮片, 药材由第一军医大学中医系
15、中药鉴定室鉴定。取番泻叶 100 g加水 1200 mL , 浸泡 15 min 后, 煎煮 15 min , 四层纱布过滤 , 滤液 50 C减压浓缩至 0. 3 g2 mL - 1 。置于 4 C冰箱中保存 , 临用时在水浴锅中加热至25 C3 。实验动物普通级昆明鼠360 只, 体重 18 22 g , 各半。由第一军医大学动物中心提供, 动物合格证号 :2002A029 。分笼饲养 , 每笼 10 只, 自由进食饮水 , 饲养 7 d ,选取活动正常, 无稀便者用于实验。半。由第一军医大学动物中心提供, 动物合格证号:2002A029。分笼饲养 ,每笼 10 只, 自由进食饮水, 饲养 7 d ,选取活动正常 , 无稀便者用于实验。1. 2 方法1. 2. 1 药物组合的正交设计伤寒论中葛根芩连汤组成为: 葛根 15 g、黄芩 9 g、黄连 9 g、
