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1、上海健坤制药有限公司 头孢羟氨苄胶囊微生物限度检查法 验证方案 方 案 起 草 人起草日期年月日 质量管理部审核审核日期年月日 总经理批准批准日期年月日 编号： VF001 上海健坤制药有限公司 验证项目立项申请 编号： QA(A)-201 -R1-00 申请部门QC 中心申请日期年月日 立项题目 头孢羟氨苄胶囊微生物限度检查法验证 计划完成日期年月日 验证原因对测定方法的可靠性进行验证类别 验证要求及目的： 由于头孢羟氨苄胶囊具有抗菌活性，在建立测定方法或原测定法的检验条件发 生改变时，可能影响检验结果的准确性，对供试品的抑菌活性、测定方法及检查法的可靠 性进行验证。 立项部门负责人签名：
2、主管部门意见签名：年月日 QA 中心意见签名：年月日 验证委员会意见签名：年月日 编制验证方案的要求及完成日期 验证完成要求及日期 总经理签名：年月日 备注： 上海健坤制药有限公司 头孢羟氨苄胶囊微生物限度检查法验证实验方案 1、概述： 1.1 微生物限度检查法是检查非无菌制剂和非无菌原料、辅料受微生物污染程度的方法。 不同的处方和工艺条件生产出的样品、不同的仪器或材料及实验环境条件、不同实验方法 等均可能对检验结果产生影响。当检验样品有抑菌性时， 它们会掩盖药品已受污染的事实 或造成低于实际污染水平的菌检结果。本方案主要依据中国药典2005 版二部附录微 生物限度检查法制定。验证步骤包括细菌
3、数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 2、验证目的： 在上述处方和工艺不变的情况下，生产出头孢羟氨苄胶囊，作为试验对象，依据中国 药典2005 版要求，制订了微生物限度检验操作规程，使用之前， 必须做计数方法的验证。 以证明该方法对头孢羟氨苄胶囊微生物限度检验的准确性和可靠性。 3、验证范围： 本公司现生产的头孢羟氨苄胶囊产品的微生物限度及控制菌检查。 4、责任： 4.1 QC 检验员对实验过程负责，确保数据的准确性。 4.2 复核人员对实验数据进行复核，确保验证方案的准确性。 5、验证内容： 5.1 验证所需环境、设备器具及其灭菌条件。 5.1.1 操作室： 阳性对照室、微生物限度检查室。 5
4、.1.2洁净级别：洁净度10000级，局部放置 100级净化工作台。 5.1.3主要设备、器具： 序号设备名称型号厂家 1 高压蒸汽灭菌器LS-B50L 上海华线医用核子仪器有限公司 2 微波炉WP700（MS-2089T）天津乐金电子电器有限公司 3 净化工作台SDJ 上海淀山湖净化设备厂 4 电子天平JA5002 上海天平厂 5 生化培养箱SHP-150 上海精宏实验设备有限公司 上海健坤制药有限公司 6 霉菌生化培养箱SHP-150 上海精宏实验设备有限公司 5.1.4设备器具灭菌条件： 应在 121高压蒸汽灭菌 30min 或 160烘干灭菌 2 小时达无菌。 5.2. 所需培养基 p
5、H7.0 无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液 0.9%无菌氯化钠溶液 5.3. 所需菌种 大肠埃希菌 (Escherichia coli)CMCC(B)44 102 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus )CMCC(B)26 003 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)CMCC(B)63 501 白色念珠菌 (Candida albicans)CMCC(F)98 001 5.4 方法：薄膜过滤法 5.4.1 取供试品加 pH7.0 氯化钠 -蛋白胨缓冲液溶解稀释成1：10，得供试液； 5.4.2 在直径 90mm 的无菌平皿中，注入1520ml 温度不超过 45
6、的溶化的营养琼脂培养 基，玫瑰红钠琼脂培养基，混匀，凝固。取1ml 上述制备的试验菌液，滤过，取出膜，贴 在已经浇好琼脂培养基的平皿上，测定其加入的试验菌菌数。 5.4.3 在适当的条件下培养，观察其是否有微生物生长。 5.4.4 然后将培养基分四组，试验组、菌液组、供试品对照组、稀释剂对照组。至少应进 行 3 次独立平行试验，并分别计算供试品组和对照组试验菌回收率。 5.4.5 合格判断标准 3 次独立的平行试验中，阴性对照不得有菌生长，稀释剂对照组的菌回收率应均不低于 70%。若试验组的菌回收率均不低于70%，则该试验方法适用本公司头孢羟氨苄胶囊微生 物限度 5.5 具体操作 5.5.1检
7、品来源：上海健坤制药有限公司 批号：取 2007 年生产的三批产品 5.5.2 菌液的制备 A 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤 培养基中，培养 1824 小时。 用 0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含 50100cfu 的菌悬液。 上海健坤制药有限公司 B 白色念珠菌的培养物至改良马丁琼脂培养基中，培养2448 小时，用 0.9%无菌氯化 钠溶液制成每 1ml 含 50100cfu 的菌悬液； 5.5.3 供试液的制备 取供试品 10g，加 pH7.0 无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液 100ml，制成即为 1：10供试液。 5.5.4 回收率测定 A 阴性对照
8、试验 取 4 个平皿，分成两组， 一组倾注营养琼脂培养基， 另一组倾注玫瑰红钠琼脂培养基， 分别取 pH7.0 无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液 1ml，薄膜过滤，作为阴性对照组。阴性对照不得 有菌生长。 B 试验组 取 8 个平皿，分成四组，一、二、三组倾注营养琼脂培养基，四组倾注玫瑰红钠琼脂 培养基。分别取 110 供试液 1ml 薄膜过滤、冲洗量5 次，每次 100ml，在最后一次冲洗 液中加入试验菌株， 一组加入 1ml 浓度为 50-100cfu 金黄色葡萄球菌试验菌， 二组加入 1ml 浓度为 50-100cfu 枯草芽孢杆菌试验菌，三组加入1ml 浓度为 50-100cfu 大肠埃希菌
9、试验 菌，四组加入 1ml 浓度为 50-100cfu 白色念珠菌试验菌，滤过，取出膜，正面贴在已经浇 好琼脂培养基的平皿上，置30-35培养箱培养 24-48 小时观察结果。置23-28的培养箱 培养 24-72 小时观察结果。作为试验组。 C 菌液组 取 8 个平皿，分成四组，一、二、三组倾注营养琼脂培养基，四组倾注玫瑰红 钠琼脂培养基。 用薄膜过滤法， 一组加入 1ml 浓度为 50-100cfu 金黄色葡萄球菌试验 菌，二组加入1ml 浓度为 50-100cfu 枯草芽孢杆菌试验菌，三组加入1ml 浓度为 50-100cfu 大肠埃希菌试验菌，四组加入1ml 浓度为 50-100cfu
10、 白色念珠菌试验菌， 滤过，取出膜，正面贴在已经浇好的平皿上， 一、二、 三组置 30-35培养箱培养 24-48 小时观察结果。四组置23-28的培养箱培养 24-72 小时观察结果。作为菌液组。 D 供试品对照组 取 4 个平皿，一组倾注营养琼脂培养基， 二组组倾注玫瑰红钠琼脂培养基，分别取 1 10 供试液 1ml 薄膜过滤、冲洗量5 次，每次 100ml，取出膜，贴在已经浇好琼脂培养基的 平皿上， 一组置 30-35培养箱培养 24-48小时观察结果。二组置 23-28的培养箱培养 24-72 小时观察结果，作为供试品对照组。 上海健坤制药有限公司 E 稀释剂对照组 取 8 个平皿，分
11、成四组，一、二、三组倾注营养琼脂培养基，四组倾注玫瑰红 钠琼脂培养基。用薄膜过滤法，每张膜上均加入ph7.0的氯化钠 -蛋白胨缓冲液 1ml， 抽滤后，一组加入 1ml 浓度为 50-100cfu 金黄色葡萄球菌试验菌， 二组加入 1ml 浓度 为 50-100cfu 枯草芽孢杆菌试验菌， 三组加入 1ml 浓度为 50-100cfu 大肠埃希菌试验 菌，四组加入 1ml 浓度为 50-100cfu 白色念珠菌试验菌， 滤过，取出膜，贴在已经浇 好琼脂培养基的平皿上，一、二、三组置30-35培养箱培养 24-48 小时观察结果。 四组置 23-28的培养箱培养 24-72 小时观察结果。 5.
12、5.5 回收率的计算 细菌培养温度控制为3035，时间为 48 小时，逐日点计菌落数，以48 小时的菌落 数报告和计算回收率； 霉菌、酵母菌培养温度控制为2328，时间为 72 小时， 24 小时、 72 小时分别点计 菌落数，以 72 小时的菌落数报告和计算回收率。 稀释剂对照组菌落数 稀释剂对照组菌回收率 %= 100% 菌液组的平均菌落数 试验组平均菌落数供试品对照组平均菌落数 试验组的菌回收率 %= 100% 菌液组的平均菌落数 5.6 控制菌检查验证 5.6.1大肠埃希菌检查法：常规法 5.6.2供试液的制备 取供试品 10g，加 pH7.0 无菌氯化钠 -蛋白胨缓冲液 100ml
13、研磨溶解，制成即为1：10 供试液。 A 试验组：取 1：10 供试液 10ml 加入 100ml 胆盐乳糖培养基中，同时加入上述大肠 埃希菌 液 10-100cfu,置 35培养箱 24 小时，取上述培养物 0.2ml，接种至含 5mlMUG 培养 基的试管内， 培养，于 5 小时、24 小时在 366nm紫外线下观察， 同时用未接种的MUG 培 养基作本底对照。管内培养物应呈现荧光，为MUG 阳性；观察后，沿培养管的管壁加入 数滴靛基质试液，观察结果。 上海健坤制药有限公司 B 阴性菌对照组：设定阴性对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性，验证大肠 埃希菌的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌。
14、 取 1：10 供试液 10ml 加入 100ml 胆盐乳糖培养基中，同时加入上述金黄色葡萄球菌 菌液 10-100cfu，置 35培养箱内 培养 24 小时，观察结果。 5.6.3 合格判断标准 试验组应为阳性即检出试验（大肠埃希菌）菌；阴性菌对照组为阴性即不得检出阴 性对照菌。 5.7 验证结果与评定 5.7.1 小组成员负责收集各项验证试验记录，根据验证试验数据起草验证分析评价及验证 结果，交验证小组组长，作为起草验证报告的依据。 5.7.2 验证小验负责对验证结果进行综合评审，做出验证结论。 上海健坤制药有限公司 验证总评价 编号： QA(A)-201 -R3-00 验证项目名称 验证起始日期 验证小组成员 参加验证部门 验证结果报告概要： 结论： 验证小组组长：年月日 验证委员会评价： 总负责人：年月日 备注： 上海健坤制药有限公司 验证证书 编号： QA(A)-201 -R2-00 验 证 项 目 验证要求及目的 验证报告编号 验证报告名称 该 验 证 项 目 及 报 告 已 经 审 核 无 误 ， 予 以 批 准 。 特 此 证 明 。 QA 主管：年月日 总经理：年月日 上海健坤制药有限公司
