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1、生物技术核心课程,Genetic Engineering 基 因 工 程,基因工程纲要,第一章 基因工程概论 第二章 基因工程的酶学基础 第三章 基因工程载体概述 第四章 基因工程的主要技术及原理 第五章 目的基因的克隆与分离 第六章 基因的转移与重组体的筛选和鉴定 第七章 克隆基因的表达 第八章 基因工程的应用,用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA连接酶,DNA聚合酶,核酸外切酶,核酸修饰酶,第二章 基因工程的酶学基础,单链DNA内切酶,核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。,第一节 限制性核酸内切酶,一、基本概念及其生
2、物功能,核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核酸链发生水解断裂的蛋白酶。,第一节 限制性核酸内切酶,一、基本概念及其生物功能,特异水解断裂RNA分子，核糖核酸酶（RNase）， 特异水解断裂DNA分子，脱氧核糖核酸酶（DNase）。,从核酸分子末端逐个降解核苷酸，叫外切核酸酶； 从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段，叫内切核酸酶,按水解断裂核酸分子的方式:,限制性内切核酸酶(Restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列(4-8bp)，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。,第一节 限制性内切核酸
3、酶,一、基本概念及其生物功能,截至2007年8月，从各种不同的微生物中分离出了限制性内切酶3819种，已经商品化的有624种。,2. 性质,主要是从原核生物中分离纯化出来。,内切酶，即在核酸分子链的内部制造切口的酶。,帮助细菌限制外来DNA的入侵,3. 功能,1. 来源,1,1两种不同来源的入-噬菌体 （ 入- K ，入-B ）。 2能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株 ，B 株 ）。 3当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，（ 入K-B ，入B-K ）感染下降数千倍。 4一但 入K 噬菌体在 B 株成功，由 B 株繁殖出 入-K 后代，能感染 B 株, 不能再感染原来 K株.称为：宿主细胞
4、的限制和修饰作用,宿主细胞的限制和修饰作用,限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。,（1）限制（Restriction）,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰（Modification）,供质粒扩增的大肠杆菌菌株多数含有两种位点特异性的DNA甲基化酶：,GATC 腺嘌呤引入甲基, Dcm甲基化酶,CCAGG或CCTGG序列在第二个C上引入甲基, Dam甲基化酶,2. 入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中，1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护.2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。-（
5、修饰）,限制和修饰作用的分子机制：,1. 大肠杆菌宿主细胞 K株，B 株 ，有各自的限制和修饰系统。,3. 外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 -（限制）,限制和修饰作用的分子机制：,4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5接受了新宿主菌甲基化修饰的同时，丧失了原宿主菌修饰的标记，丧失在原宿主细胞中的存活能力。,I 型限制性内切酶,目前主要鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。,二、限制性内切酶的类型,II 型限制性内切酶,III型限制性内切酶,IV型限制性内切酶,首先由M. Meselson和R. Yuan在
6、1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。,（1）识别位点序列,EcoB： TGA*(N)8TGCT EcoK：AA*C(N)6GTGC,1. I型限制性内切酶,如 EcoB和 EcoK。,未甲基化修饰的特异序列。,N：表示任何一种核苷酸,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）为辅助因子,（3）作用机理,在距离特异性识别位点约1000-1500 bp处随机切割。,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割位点,1970年，H.O. Smith和K.W. Wilcox首先从流感嗜血杆菌d株中分离出来。,（1）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列，多数是
7、回文序列。识别序列长度为46bp，少数识别8bp（表2-2）。,2. II型限制性内切酶,分离的第一个酶是Hind II，其次是 Hind III,5GAA TTC33CTT AAG5,特点有二：,回文序列：反向重复序列，双链DNA中含有两个结构相同，方向相反的序列,1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。 2、这两股DNA链若按同方向阅读（如5/ 3/），其核苷酸顺序相同。,5GTNAC33CANTG5,（2）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。如：,识别位点处。,DNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DNA的碱基
8、组成是均一的，对于任何一种限制酶的切割频率，理论上应为：1/4n，n表示该限制酶识别的碱基数。识别4个碱基的，每256 （44）个碱基有一个识别序列识别5个碱基的，每1024（45）个碱基有一个识别序列识别6个碱基的，每4096（46）个碱基有一个识别序列,切割产生的DNA片段的理论大小为？,限制性内切酶的切割频率：是指限制性内切核酸酶在DNA分子中预测的切点数。,（2）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平末端（blunt end）。如：,识别位点处。,（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个核苷酸单链的末端。,分两种类型：
9、, 5端凸出（如EcoR I切点）,GAATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,从 5-P末端切割双链DNA的两链，产生5-P单链延伸的黏性末端,EcoR I等产生的5粘性末端,EcoR I 37 ,退火 4-7 ,5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5,OH,P,OH,P, 3端凸出（如Pst I切点）,CTGCAG,GACGTC,5-,-3,3-,-5,在其识别序列的对称轴两侧，从 3-OH 末端切割双链DNA的两条链，产生具有 3-OH 单链延伸的黏性末端。,Pst I等产生的3粘性末端,5 G-C-T-C-
10、T-G-C-A-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,Pst I 37 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 3,3 C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,退火 4-7 ,5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3,3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,OH,P,OH,P, 连接便利,粘性末端的意义,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,这比连接两个平齐末端容易的多。, 补平成平齐末
11、端, 5末端标记,凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。（5 *p-AATTC-OH 3）,粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。,（4）同裂酶 (Isoschizomers),来源不同，识别位点的序列相同的限制性内切酶。 （原型酶同裂酶）, 完全同裂酶（同切点酶）,识别位点和切点完全相同 如Hind 和Hsu I。,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5 Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5, 不完全同裂酶（新裂酶） ：,Xma I 5-CCCGGG -3 3-GGGCCC-5 Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5,识别位点相
12、同，但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。,（5）同尾酶 （Isocaudamers）,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl ,5-RGATCY-3 3-YCTAGR-5,Xho ,R代表嘌呤；Y代表嘧啶,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3AI,同尾酶连接后连接处的序列将变得“面目全非”，一般不能再被原来的酶识别。,？,5-G 3-CCTAG,GATCT-3 A
13、-5,BamH I,Bgl ,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl ,在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。,（6）s型限制性内切酶,移动切割（shifted cleavage):,GACGCNNNNN,Hga I,CTGCGNNNNNNNNNN,5,3,3. III型限制性内切酶,有专一的识别序列，但不是对称的回文顺序，在识别序列旁边一定数目核苷酸对的位置上切割双链。但这几个核苷酸对的切割位点不是特异的。,切割产生的DNA片段具有各种单链末端 在基因工程操作中用途不大。,EcoPI: AGACC,EcoP15: CAGCAG,4. IV型限制性内切
14、酶,新鉴定出来的一类限制酶。只切割碱基已被甲基化、羟甲基化、葡糖羟甲基化的DNA序列。,除EcoKMcrBC外，识别序列尚未确定，目前尚无应用。,核酸限制性内切酶的类型及主要特性,若载体DNA用M酶切开，则带有N酶黏性末端的外源DNA片段中，能直接与载体拼接的是（ ）M N M N A、A/AGCTT T/TCGAA B、C/CATGG ACATG/G C、GAGCT/C G/AGCTC D、G/GATCC A/GATCT,下列DNA 片段中含有回文结构的是（ ） GAAACTGCTTTGAC GAAACTGGAAACTG GAAACTGGTCAAAG GAAACTGCAGTTTC,D,D,1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：,三、限制性内切酶的命名,用属名的第一个字母（大写，斜体）和种名的头两个字母（小写，斜体）构成酶的基本名称，表示寄主菌的物种名。,大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。,4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。,2. 用一个正体字母表示菌株或型。如EcoR、Hind）。,
