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1、基因诊断和基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy,Section Genetic Diagnosis 基因诊断,内源性基因变异基因结构突变基因表达异常 外源基因的入侵,基因诊断的依据基因变异:,核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） 聚合酶链式反应(PCR) 单链构象多态性（SSCP） 限制性内切酶谱分析法 限制性片段长度多态性（RFLP） DNA序列测定（DNA sequencing） 生物芯片（biochips）,1. 核酸分子杂交：在复性过程中，将不同来源的单链DNA分子或RNA分子放在同一溶液中，只要在DNA或RNA的单链
2、分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，就可以在不同的分子间形成杂化双链，这种现象称为核酸分子杂交。,探针技术,探针是经过特殊标记的核酸片段，具有特定的序列，能够与待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的同源序列。 标记物：同位素、生物素或荧光染料 探针种类(广义）：DNA(合成的寡聚核苷酸片段，基因组DNA、cDNA)、RNA、Protein,（1） Southern 印迹杂交：提取受检者DNA限制性内切酶消化DNA以产生特定长度的片段凝胶电泳分离 变性处理DNA成单链DNA转印到膜上并使其牢固结合将标记的探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。,（2） Northern印迹杂交：提
3、取受检者体内mRNA，经变性琼脂糖凝胶电泳后，转移到固相支持物上，通过分子杂交，检测受检者体内特定的mRNA分子的含量与大小。,（3）等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针杂交寡核苷酸中的碱基错配会大大影响杂交分子的稳定性，因此可用人工合成的、针对正常和突变等位基因的特异性寡核苷酸探针进行杂交，检测点突变。根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸(M)；二是相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸(N)，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。,如：载脂蛋白B-100缺陷症的诊断 apoB基因编码3500号氨基酸残基的密码子CGG CAG精氨酸 谷氨
4、酰胺,野生型探针5-GCACACGGTCTTC (N) 突变型探针5-GCACACAGTCTTC (M) 纯合突变：只与M杂交，不与N杂交 杂合突变：既与M杂交，又与N杂交 无突变：只与N杂交，不与M杂交 新类型突变: 既不与M杂交，也不与N杂交,2.聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction, PCR）,模板 引物 dNTP Mg2+ Taq DNA聚合酶,变性,延伸,退火,3. PCR/单链构象多态性分析（PCR-SSCP) （single-strand conformation polymorphism, SSCP）：相同长度的单链DNA基因碱基序列不同，甚至单
5、个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在电泳时泳动速率不同。其他方法还有PCR/ASO法、PCR/限制性酶谱法、PCR/RFLP法。,PCR-SSCP分析原理示意,由于基因的突变使DNA单链的构象发生改变，电泳时其区带位置发生改变，但是具体是哪个碱基发生突变还需要通过测序确定。,4. 限制性内切酶谱分析法 利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。 如镰状红细胞贫血：珠蛋白第六个密码子发生单个碱基突变: A T谷 缬,5. 限制性片段长度多态性
6、（RFLP）分析（restriction fragment length polymorphism, RFLP）在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异（称为中性突变），中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该DNA片段就会产生长度不同的片断，称为限制性片段长度多态性 (RFLP)。RFLP按孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一致病基因与特异的多态性片断紧密连锁，就可用这一多态性片段作为一种“遗传标志”，来判断家庭成员或胎儿是否为致病基因的携带者。,6.基因芯片技术,基因芯片（Gene chip/DNA chip）
7、又称为DNA微矩 阵，是包被在固相载体上的高密度DNA的微阵列。即将许 多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排 列、固定于单位面积的支持物上 。(1)基因芯片的类型： 寡核苷酸芯片：采用固相原位合成技术制备的，或用传统方法合成后再固定于芯片上的寡核苷酸探针阵列。 DNA微矩阵（DNA Microarray）：将DNA探针通过自动化点样技术固定于特定的固相支持物如玻璃表面，然后再与靶序列杂交。,(2)基因芯片技术的原理DNA芯片技术是将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段有规律地排列、固定于支持物（如膜、硅片或玻璃片）上，然后通过类似核酸杂交的的方法与待测的标记样品按碱基配对原则进
8、行杂交，再通过检测系统对其进行扫描，并用相应软件对信号进行比较和检测，得到所需的生物信息。其特点是可进行基因的高通量、大规模、平行化、集约化的信息处理和功能研究。,(3)基因芯片技术的应用:疾病诊断（遗传病、肿瘤和病原体诊断） 新药筛选和毒理学研究 突变/多态性检测 单核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。 基因表达分析 发现新基因,(4)表达谱基因芯片的特点及其应用利用基因芯片可进行高通量基因表达平行分析，是基因功能研究的重要手段。对来源于不同个体（正常人与患者）、不同组织、不同细胞周期、不同发育和分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、
9、不同治疗阶段）下的细胞内的mRNA或逆转录后产生的cDNA与表达谱基因芯片进行杂交，可以对这些基因表达的个体特异性、组织特异性、发育阶段特异性、分化阶段特异性、病变特异性、刺激特异性进行综合的分析和判断，迅速将某个或几个基因与疾病联系起来，极大地加快这些基因功能的确立，同时进一步研究基因与基因间相互作用的关系。,目 录,采用表达谱基因芯片研究基因表达与传统的Northern Blot相比有许多重要的优点：检测系统的微型化，对样品等需要量非常小同时研究上万个基因的表达变化，研究效率明显提高能更多地揭示基因之间表达变化的相互关系，从而研究基因与基因之间内在的联系检测基因表达变化的灵敏度高，可检测丰
10、度相差几个数量级的表达情况节约费用和时间,1. 遗传病的基因诊断：遗传病是指由于基因发生突变所引起的、可以传给子代的疾病。遗传病包括：（1）单基因遗传病：由于单个基因座上存在着基因突变而引起的遗传病。（2）多基因遗传病：多个基因座存在基因突变。,2、恶性肿瘤的基因诊断:癌基因被激活而过量表达或抑癌基因丢失可导致肿瘤发生，因此对肿瘤的诊断可检测癌基因突变或抑癌基因的突变。如：约一半以上的肿瘤都有抑癌基因P53的点突变，常见的点突变主要发生在第5、6、7、8外显子中。P53的突变的检测方法： （1）PCR-SSCP：此法可检测出发生突变的外显子。 （2）DNA序列分析：可以确定点突变的位置及缺失/
11、插入密码子的数目。基因诊断除用于细胞癌变机制的研究外，还可对肿瘤进行诊断、分类分型和愈后检测。,3、致病病原体的检测:对于外源入侵的基因，一旦阐明其部分核酸序列，就可以设计引物和探针，用PCR或杂交方法来检测，其范围包括细菌、病毒、衣原体和支原体等一切微生物。基因诊断的特点是：可以其基因中的保守区做通用检测， 也可以选定差异较大的基因部位做分型检测； 检测的灵敏度和特异性都远高于当前的免疫学方法 所需时间已达到临床要求。 这对于难以培养的病毒（如HBV）、细菌（如结核、厌氧菌）和原虫（如梅毒螺旋体）等来说尤为适用。,基因诊断在判断个体对某种重大疾病的易感性方面也起着重要作用。基因诊断在器官移植
12、组织配型中的应用也日益受到重视。基因诊断在法医学中应用主要针对人类DNA遗传差异进行个体识别和亲子鉴定。,Section Gene Therapy 基因治疗,一、基因治疗的概念及分类： 1.基因治疗的概念： 通过分子生物学的方法将外源治疗基因导入靶细胞并有效表达，达到治疗疾病的目的。 是以改变细胞遗传物质为基础的治疗。 狭义的基因治疗，是指将目的基因导入靶细胞后，与宿主细胞内的基因发生整合，成为宿主遗传物质的一部分，使目的基因的表达产物对疾病起到治疗作用。,广义基因治疗：外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因的表达产物，以补充缺失的或失去正常功能的蛋白质；采用适当的技术抑制细胞内过度表达的基因
13、；将特定的基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；向功能异常的细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在的基因（如自杀基因），利用这些基因的表达产物达到治疗疾病的目的。,目 录,2. 基因治疗分类:,体细胞(somatic cell)基因治疗生殖细胞(germline)基因治疗,只限于某种体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正 当代及子代,基因矫正或置换基因打靶 补偿性基因治疗（基因增补） 干扰性基因治疗： 如反义核酸治疗，包括反义RNA/反义DNA，抗核酸，核酶，干扰RNA等。 非特异性基因治疗： 导入与致病基因无直接关系的基因如细胞因子基因和自杀基因等,二、基因治疗的
14、方法和策略,1.基因矫正或置换基因打靶利用正常的基因通过体内基因同源重组，原 位替换细胞内的病变基因，以纠正细胞的遗传缺 陷，从而使疾病得到治疗。特点：不影响其他任何基因的改变。,基因矫正或置换基本条件： 目的基因能有效导入靶细胞 目的基因能在靶细胞内稳定驻留 导入的目的基因能正常表达 导入的目的基因对宿主细胞完全无害,将外源基因导入病变细胞，不去除异常基因，使导入的外源基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能。这一方法也需基因置换的基本条件。已应用于临床：如严重联合免疫缺陷症（Severe Combined Immunodeficiency Disease，SCID)的基因治疗 第一个基因治疗的例
15、子（1990）,2. 补偿性基因治疗（基因增补）,SCID 是由于腺苷脱氨酶 (ADA)缺陷造成的 。该酶基因位于 #22染色体该基因缺陷使嘌呤核苷酸不能彻底分解，中间分解产物的积累阻止了T细胞的正常发育，同时影响B细胞的成熟（因为B细胞的成熟需要T细胞的帮助），从而引起免疫缺陷。由于患者失去细胞免疫功能，一旦感染很容易造成死亡。,治疗：取出患者T淋巴细胞 体外培养增殖 导入正常的ADA基因并有效表达 输回患者体内. September 14, 1990 NIH 完成第一个基因治疗的病例-Ashanti (4 year old girl) 抽取患者T 淋巴细胞，体外利用 retrovirus
16、vector 把ADA gene 导入体外培养的T 淋巴细胞，使该基因正常表达后把T细胞移植回患者体内。 Cynthia (9 year old girl ) was treated in same year缺点: WBC半衰期很短，必须定期反复治疗,又如，凝血因子VIII/IX基因缺陷血液中凝血因子VIII/IX 缺乏血友病A/B向骨髓干细胞导入以上凝血因子的正常基因可以治疗血友病。1992年，复旦大学蔡京伦教授在国内首先成功。,3. 干扰性基因治疗 反义核酸技术：,利用反意核酸进行基因治疗 反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。,包括反义RNA、反义DNA和核酶(ribozymes)三大技术。反义RNA是指能和mRNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段；反义DNA是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子；具有酶催化活性的RNA称之为核酶。,
