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1、纳豆激酶 (NattoKinase, NK) 酶活检测1）生理盐水：0.9% NaCl 蒸馏水溶解配制称取 3.6g NaCl，加入蒸馏水400mL ，振荡即可溶解，溶液为无色透明状2）PBS： 0.01mol/L 磷酸缓冲溶液配制方法：A 液（ 0.01mol/L 磷酸二氢钠水溶液） ：NaH2PO42H2O 1.56g，溶于蒸馏水中，定容1000mL。B 液（ 0.01mol/L 磷酸氢二钠水溶液） ：Na2HPO47H2O 2.68g （或Na2HPO412H2O 3.58g 或 Na2HPO42H2O 1.78g）加蒸馏水溶解，并定容至1000mL。pH=7.2 磷酸盐缓冲液（PBS）
2、缓冲液的配制上述两种溶液均无色透明，按照体积比21 混合 Na2HPO4与 NaH2PO4，所得 PBS 溶液 pH 值为 7.8。在28.0mL A 液中，加入72.0mL B 液，为 0.01mol/L PBS 溶液。3）工作溶液： 将 0.01mol/L 磷酸缓冲液和生理盐水按照1：17 的体积比例配制即可。PBS生理盐水 =117 4）琼脂糖： 1.5%，工作溶液溶解配制称取 0.75g 琼脂糖粉，加入50mL 工作溶液，混匀，微波炉内中低火力加热1min，使琼脂糖充分溶解，溶液呈完全流动、透明状态，将琼脂糖溶液放置在55水浴保温。5）凝血酶： 10U/mL ，生理盐水溶解配制将 10
3、00U 凝血酶溶于1mL 超纯去离子水中，震荡混匀， 用移液枪取100L用 0.9%生理盐水配制成10U/mL ，于 -20条件下保存一个月，仍可使用。6）纤维蛋白原：0.15% ，工作溶液 纤维蛋白原试管短暂离心，量取66.7mL 工作溶液，将纤维蛋白原粉倒入工作溶液，可观察到，纤维蛋白原为干粉，容易倒出。 最初，纤维蛋白原粉漂浮在溶液上面，轻轻振荡，纤维蛋白原粉分散下沉，可明显看到悬浮小碎片，室温放置数分钟，可观察到悬浮小碎片明显减少。 当用移液器吸取该纤维蛋白原溶液时，可感觉到溶液的粘性。取纤维蛋白原溶液1mL 装入离心管， 观察未见显著的悬浮物，再吸取 100L凝血酶溶液， 颠倒混匀，
4、此时产生泡沫，同时可看到絮状物生成并悬浮在液面处，通过此小实验，可以判断纤维蛋白原溶液及凝血酶溶液均可靠。 纤维蛋白原溶液在使用前，在55水浴中放置1min，以便倒进琼脂糖溶液后，保证琼脂糖溶液完全处于流动状态。 注意，纤维蛋白原颠倒振荡容易产生明显的泡沫，倒入琼脂糖溶液后，应轻轻摇晃混匀，否则容易形成大量气泡。7）尿激酶标准品制备：用工作溶液溶解尿激酶，尿激酶母液为105U/mL ，用 0.01mol/L PBS 溶液稀释成100U/mL 、80 U/mL 、60 U/mL 、40U/mL 、20U/mL 等梯度，实验证明，尿激酶在20条件下保存两个月仍可使用；保存在4下至少一个月都可使用，
5、但用60 U/mL 、 40U/mL 、20U/mL 、10U/mL 稀释度上样检测，溶解圈变小，提示酶活可能下降，因此，用于绘制标准曲线的尿激酶以在较短时间内使用为宜。8）琼脂糖 -纤维蛋白平板的制备琼脂糖纤维蛋白测定平板为：5mL 0.15%纤维蛋白原，5mL 1.5%琼脂糖， 0.38mL 10U/mL 凝血酶。分别配制好所需浓度的纤维蛋白原、凝血酶和琼脂糖后，将其至于55保温。首先在培养皿（直径9cm）底部铺一层2%的琼脂；然后用移液枪取10U/mL 凝血酶0.38mL 置于琼脂层上， 接着将5mL1.5% 琼脂糖溶液小心缓慢的加入到5mL0.15% 纤维蛋白原溶液中，然后迅速倒入以上
6、的培养皿中，在桌面上小心平面混匀，待冷却凝固后备用。实验表明， 10mL 琼脂糖溶液倒入9cm 平皿，形成的琼脂糖凝块，厚薄适当，因此在9cm 平皿中装载10mL 纤维蛋白反应溶液即可。以此类推，19cm 平皿中装载10mL 纤维蛋白反应溶液22mL 。一般配置 :50mL 0.15% 纤维蛋白原 ,即 0.075g，50mL 1.5%琼脂糖，即0.75g, 10U/mL 凝血酶0.38mL/10mL10=3.8mL/100mL. 纤维蛋白琼脂糖平板制备，关键有三点，一是防止反应体系过快凝结，二是避免产生大量气泡，三是反应溶液分配要均匀，溶液均匀覆盖整个平皿，平板厚薄一致。9) 打孔： 室温条
7、件下待平板凝固后，选择合适的位置打孔，孔径为2mm。10）尿激酶标准曲线的测定：分别取 10L尿激酶标准品100U/mL 、80 U/mL 、60 U/mL 、40U/mL 、20U/mL 点样于纤维蛋白平板的小孔中。放入 37恒温培养箱中反应18h，取出后从三个方向测透明圈的直径， 取平均值， 然后计算透明圈的面积，可以得到关于尿激酶活力与透明圈面积的关系，并绘制标准曲线。11）纳豆粉粗酶液的提取：精密称取0.1g 80 目的纳豆粉于小试管中，向小试管中加入5mL 生理盐水，用玻璃杯反复搅拌至颗粒完全分散，在漩涡震荡器上反复震荡10min，然后过滤，收集上清液，即得纳豆激酶粗酶液。12）纳豆激酶的活力测定：用微量移液器取粗酶液10L ，点样于纤维蛋白平板上，放入37恒温培养箱中反应 18h，然后分别测定纤维蛋白溶解圈的两个垂直直径，将其乘积近似为纤维蛋白溶解圈的面积，将此数值代入尿激酶酶活标准曲线，由此计算出相应的尿激酶单位(u/mL) ，即 纳豆激酶的酶活力。NK 酶活 (u/g)= 测定的透明圈面积对应的标准品酶活（u/ L ） 100样品稀释倍数举例：注意：测定的样品透明圈直径不应超过标准品各梯度的线性范围；每批测定样品和标准品均需在同一个平板的不同区域上进行。
