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1、第十三章 高效液相色谱法 HPLC,第一节 概述,high performance liquid chromatography,一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别 三、高效液相色谱仪流程图 四、特点,以气相色谱理论为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法,一、HPLC与经典LC区别,主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段,1经典LC：仅做为一种分离手段柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀常压输送流动相 柱效低（H，n）分析周期长无法在线检测，灵敏度差 2HPLC：分离和分析柱内径26mm，固定相粒径17%，硅胶失活载体，吸附的水固定液，分配色谱,4出
2、柱顺序：硅胶极性较大，强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱,二、液液分配色谱法（LLC）,1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分4. 反相色谱固定液极性 流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分,三、化学键合相色谱法（BPC）,（一）化学键合相 （二）反相键合相色谱（reversed bonded phase chromatography, RBPC） （三）正相键合相色谱 （nor
3、mal bonded phase chromatography, NBPC） （四）离子对色谱 （五）离子抑制色谱（了解）,（一）化学键合相,定义：利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面，而构成化学键合相,1分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） 2优点：1）使用过程不流失2）化学性能稳定，在pH28的溶液中不变质3）热稳定性好（ 固定相极性底剂（水） + 与水混溶的极性调节剂常用甲醇水、乙腈水等,3、分离机理：疏溶剂理论为代表(了解),溶质的保留机理是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力，促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合。 不是溶质分子与键合相间的色散力,续前,4流动相极性与k的关
4、系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR 5出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱 6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）,（三）正相键合相色谱法（了解）,1、固定相：极性键合相 如氰基（CN）、氨基（NH2）键合硅胶。 2、流动相：类似与以硅胶为固定相的吸附色谱法非极性或弱极性溶剂加极性调整剂 3、分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力,4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k 5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱 6适用：极性组分,续前,正相和反相色谱法的区别,（四）反相离子抑制色谱,在反相色谱中，通过加入
5、缓冲溶液调节流动相pH值，抑制 组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的,1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质或pH一定的缓冲溶液 2）k的影响因素： 选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HAc tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0pH8.0 破坏键合相与载体的结合pH3.0 腐蚀柱子 3）适用：弱酸、弱碱物质pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物,（五）反相离子对色谱法（IPC或PIC）,反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分 与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离模型,1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱四
6、丁基季胺盐分析酸 2）影响k的因素 离子对试剂的种类：碳链长度增加，溶质的k增大； 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大 固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。 3）适用：较强的有机酸、碱,反相离子对色谱法模型,3,3,+,+,(,),+,3,s,3,(,+,固定相：弱极性,+,(,),+,B,),+,流动相：极性,通式,2018/9/7,第四节 固定相,固定相（stationary phase）是HPLC的关键组成部分，它直接关系到柱效与分离度。1、液固色谱固定相液-固吸附色谱固定相, 多是具有吸附活性的吸附剂。 常用有硅胶、氧化铝及高分子多孔
7、微球等。 2、化学键合相 （1）优点（P526；5条，注意pH使用范围28） （2）分类 非极性键合相：十八烷基键合相（ODS或C18）是最常用的非极性键合相。 中等极性键合相 极性键合相,2018/9/7,第五节 流动相（溶剂系统）,对流动相的要求： 与固定相不发生化学反应。 对试样有适宜的溶解度。使k在110范围内（可用范围）或25（最佳范围），k小，tR小； k大，tR大，峰宽变大； 与检测器相适应。例如用紫外检测器时，选用截止波长小于检测波长的溶剂。 纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压，提高柱效。,2018/9/7,（一）流动相对分离的影响（分离方程式）,k 受溶剂配
8、比的影响,n由色谱柱（固定相）性能决定,主要受溶剂种类的影响,（二）流动相的极性和选择性,流动相的极性（强度） 正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强 反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 例：固定相：ODS；流动相：甲醇-水（50：50）；tR=20min；若要缩短分析时间，如何调节流动相？流动相的选择性 不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同混合溶剂（二元或多元流动相）,续前,（三）洗脱方式,1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）类似GC的等温度洗脱；以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵） 具有方法简便、重复性好、色谱柱易再生等优点。 对于成分复杂的样品，往往不能兼顾某些性质相差很大组分的分离要求2）梯度洗脱：类似GC的程序升温在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例，即不断改变其极性（两个泵） 。适于分析极性差别较大的复杂组分,缩短分析周期；提高分离效果；改善峰形；增加检测灵敏度 有时引起基线漂移、重复性较差,2018/9/7,峰的鉴别：1苯； 2氯苯； 3对二氯苯 41，2，3三氯苯；51，3，5三氯苯； 61，2，4三氯苯；71，2，3，4四氯苯； 81，2，4，5四氯苯； 9五氯苯； 10. 六氯苯,
