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1、- 1 - 兔肌肌酸激酶的分离纯化 及部分性质的测定 一、实验目的： 通过兔肌肌酸激酶的分离纯化及其酶活性质的测定，进一步熟悉和综合运用各种分 离提纯办法，熟练掌握生化实验的基本方法。 进一步掌握酶的分离纯化方法，了解兔肌肌酸激酶的部分酶性质。 二、实验内容及实验技术： 实验内容： 1.肌酸激酶概况； 2.肌酸激酶的催化机制； 3.肌酸激酶的测活方法pH 比色法； 4.肌酸激酶的分离纯化； 5.肌酸激酶的动力学参数测定； 6.肌酸激酶DTNB修饰反应动力学及酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定。 实验技术： 1.颈动脉放血杀兔子； 2.机械法粉碎动物材料的方法； 3.盐析、等电点沉淀和有机溶剂变
2、性、热变性除杂蛋白； 4.盐浴与冰盐浴盐析目的蛋白肌酸激酶(CK)； 5.乙醇分级除杂蛋白和沉淀目的蛋白肌酸激酶； 6.-8 ， 12000r/m 高速冷冻离心分离杂蛋白与目的蛋白； 7.透析法除残余有机溶剂小分子； 8.凸形梯度洗脱和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化目的蛋白CK ； 9.pH比色法测定酶活性； 10.A280光吸收法测定酶浓度； 11.酶的动力学参数（Ka,Vmax）的测定； 12.CK的 DTNB修饰反应动力学； 13.酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定； 14.SDS-PAGE 测定亚基的分子质量和CK纯度； 15.凝胶层析测定CK分子质量。 三、实验原理： 肌酸激酶通
3、常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个 与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP 再生有直接关系的重要激酶。肌酸激酶可逆地催化 肌酸与 ATP 之间的转磷酰基反应： - 1 - 兔肌肌酸激酶的分离纯化 及部分性质的测定 一、实验目的： 通过兔肌肌酸激酶的分离纯化及其酶活性质的测定，进一步熟悉和综合运用各种分 离提纯办法，熟练掌握生化实验的基本方法。 进一步掌握酶的分离纯化方法，了解兔肌肌酸激酶的部分酶性质。 二、实验内容及实验技术： 实验内容： 1.肌酸激酶概况； 2.肌酸激酶的催化机制； 3.肌酸激酶的测活方法pH 比色法； 4.肌酸激酶的分离纯化； 5.肌酸激酶的动力学参
4、数测定； 6.肌酸激酶DTNB修饰反应动力学及酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定。 实验技术： 1.颈动脉放血杀兔子； 2.机械法粉碎动物材料的方法； 3.盐析、等电点沉淀和有机溶剂变性、热变性除杂蛋白； 4.盐浴与冰盐浴盐析目的蛋白肌酸激酶(CK)； 5.乙醇分级除杂蛋白和沉淀目的蛋白肌酸激酶； 6.-8 ， 12000r/m 高速冷冻离心分离杂蛋白与目的蛋白； 7.透析法除残余有机溶剂小分子； 8.凸形梯度洗脱和DEAE-52阴离子交换柱层析纯化目的蛋白CK ； 9.pH比色法测定酶活性； 10.A280光吸收法测定酶浓度； 11.酶的动力学参数（Ka,Vmax）的测定； 12.CK的 D
5、TNB修饰反应动力学； 13.酶表面可反应巯基数和总巯基数的测定； 14.SDS-PAGE 测定亚基的分子质量和CK纯度； 15.凝胶层析测定CK分子质量。 三、实验原理： 肌酸激酶通常存在于动物的心脏、肌肉以及脑等组织的细胞浆和线粒体中，是一个 与细胞内能量运转、肌肉收缩、ATP 再生有直接关系的重要激酶。肌酸激酶可逆地催化 肌酸与 ATP 之间的转磷酰基反应： - 3 - 肌酸激酶的测活方法（pH-比色法）： 肌酸激酶在催化正向反应时，随着ATP 向肌酸上转移磷酰基的同时，生成等摩尔的 H +，其最适 pH 为 7.5-9.0 ，在此范围内测定H + 的生成速度，可以作为酶活力的指标。 本
6、实验采用百里酚蓝作为pH 指示剂，在分光光度计上通过pH-比色法测定肌酸激酶的 活性，即在597nm 波长下，监测吸光度的变化。在比色皿中酶催化反应生成的H +使溶 液的 pH 值降低， 底物溶液的颜色逐渐由深紫红色变为黄绿色，吸光度值A597不断降低。 在 pH-比色法中，肌酸激酶测活的底物溶液需要新配。配制方法见试剂部分。 测活时，取1.0ml 的底物溶液置于微量比色皿中，加入10 l 酶溶液，迅速盖盖，混 匀后立即监测597nm 处光吸收的变化，每15 秒或 30 秒读一次吸光度值(A597 )，共读取 8 个数据点，用A597对时间作图，从图中求出每min 吸光度值的变化，即A597。
7、并按 下式计算酶的比活力（U） ： 稀释倍数 B A VC VA U 597 3.1 （mol(min mg)） 其中： 1.3 为吸光度的变化换算成H +的系数。 VA =1.0ml ( 底物溶液 )， VB =0.01ml ( 加入的酶溶液)。 C：加入酶溶液的浓度。 酶溶液浓度C 的测定按其在280nm 处的吸光度值来确定，其百分吸光 系数为E 1 1cm=8.8。 即：稀释倍数 8.8 10 280 A C 四、试剂： 1.KCl： 0.01mol/L ， 200ml。 (0.15g KCl 加水至 200ml) 2.NH4OH：1.7mmol/L ，1000ml。(取 0.12ml
8、浓氨水，加H2O 至 1000ml) 3.柠檬酸铵： 0.05mol/L ，pH9.0，1000ml。(称 12.15g 溶于 1000ml H2O) 4.Tris-HCl ：0.1mol/L ，pH8.0，1000ml。 （称 Tris 12.1g ，取 HCl 23ml ，调 pH 为 8.0， 加水至 1000ml） 5.NH4Cl：研细， 10g。 6.NH4OH：5mol/L ，100ml ( 公用 ) 7.MgSO4：2.0mol/L ， pH8.5， 20ml。(公用 ) 8.MgAC2：0.07mol/L ，pH9.0，100ml 。(公用 ) 9.NaOH：0.2，0.5，1
9、.0， 2.0，5.0( mol/L ) 。(公用 ) 10.HAC：0.2mol/L 。 11.95% CH3CH2OH（乙醇） 12.粗盐 13.底物溶液的配制： 通常一次配制20ml，当天使用。 - 4 - 配制方法：取 10ml 48mmol/L 的肌酸溶液， 加入 1.0ml 0.1mol/L 的 MgAC 2， 2.0ml 0.1 的百里酚蓝 (称 100mg 百里酚蓝，加 20ml 乙醇溶解后再加水60ml)， 1.0ml 0.1mol/L pH9.0 的 Gly-NaOH 缓冲液，称 48mg ATP 溶于此溶液， 再补加水 5.0ml， 用 0.10.2mol/L NaOH
10、仔细调此溶液的颜色为深紫红色（吸光度为1.82.2）即可。 五、实验步骤： （一）兔肌肌酸激酶的分离纯化： 1.将兔子化冻后取大腿肌50g， 去除结缔组织和神经后剪碎。加 200ml 0.01mol/L KCl ， 用组织打碎机 (或食品加工机 )和高速分散器各粉碎3 次以上， 每次不超过30s， 以防 过热。 2.冰浴搅拌提取15-30min，用 8000r/min ，0，离心10min，弃去沉淀，测上清体积 为 V1，取样 0.5ml。 V1=81.0ml 。 3.在其余上清中加入研细的NH4Cl 至浓度为0.1mol/L （逐滴加入） 。 加入的 NH4Cl 的量： MNH4Cl=5.3
11、5V1=0.431 g。 用 5mol/L NH 4OH 调 pH 至 9.0（最适 pH 值） ，冰浴搅拌30min（0） 。 4.加入 1.5 倍 V1体积的 95冷乙醇， 20搅拌2.5h。以热变性法用60%的有机溶剂 变性除杂蛋白。 1.5V1=121.50ml 8，8000r/min 离心10min。 弃沉淀，测上清液体积为V2，取样 0.5ml。 V2=155.5ml 5.其余上清液中加入VA ml 的 2 mol/L MgSO4(pH=8.5) ，至终浓度为0.03mol/L 。 03.0 2 2 VV V A A ，VA=2.37ml 1.5VA=3.55ml 再补加 1.5
12、VA体积的 95%冷乙醇，逐滴加入，搅拌30min ， 8， 8000r/min 离 心 10min，弃去上清。 6.沉淀加 1/10 V1体积的 MgAC2 (0.07mol/L ，pH=9.0) 溶解悬浮 (冰浴 )。冰浴搅拌1h 后， 0， 12000r/min 离心10 min，弃去沉淀，测上清体积为V3，取样 0.5ml。 V3=13.2ml 7.其余上清液用0.5-1mol/L NaOH 调 pH=8.0。 置冰盐浴内缓慢加入VB体积的 95的 - 4 - 配制方法：取 10ml 48mmol/L 的肌酸溶液， 加入 1.0ml 0.1mol/L 的 MgAC 2， 2.0ml 0
13、.1 的百里酚蓝 (称 100mg 百里酚蓝，加 20ml 乙醇溶解后再加水60ml)， 1.0ml 0.1mol/L pH9.0 的 Gly-NaOH 缓冲液，称 48mg ATP 溶于此溶液， 再补加水 5.0ml， 用 0.10.2mol/L NaOH 仔细调此溶液的颜色为深紫红色（吸光度为1.82.2）即可。 五、实验步骤： （一）兔肌肌酸激酶的分离纯化： 1.将兔子化冻后取大腿肌50g， 去除结缔组织和神经后剪碎。加 200ml 0.01mol/L KCl ， 用组织打碎机 (或食品加工机 )和高速分散器各粉碎3 次以上， 每次不超过30s， 以防 过热。 2.冰浴搅拌提取15-30
14、min，用 8000r/min ，0，离心10min，弃去沉淀，测上清体积 为 V1，取样 0.5ml。 V1=81.0ml 。 3.在其余上清中加入研细的NH4Cl 至浓度为0.1mol/L （逐滴加入） 。 加入的 NH4Cl 的量： MNH4Cl=5.35V1=0.431 g。 用 5mol/L NH 4OH 调 pH 至 9.0（最适 pH 值） ，冰浴搅拌30min（0） 。 4.加入 1.5 倍 V1体积的 95冷乙醇， 20搅拌2.5h。以热变性法用60%的有机溶剂 变性除杂蛋白。 1.5V1=121.50ml 8，8000r/min 离心10min。 弃沉淀，测上清液体积为V2
15、，取样 0.5ml。 V2=155.5ml 5.其余上清液中加入VA ml 的 2 mol/L MgSO4(pH=8.5) ，至终浓度为0.03mol/L 。 03.0 2 2 VV V A A ，VA=2.37ml 1.5VA=3.55ml 再补加 1.5 VA体积的 95%冷乙醇，逐滴加入，搅拌30min ， 8， 8000r/min 离 心 10min，弃去上清。 6.沉淀加 1/10 V1体积的 MgAC2 (0.07mol/L ，pH=9.0) 溶解悬浮 (冰浴 )。冰浴搅拌1h 后， 0， 12000r/min 离心10 min，弃去沉淀，测上清体积为V3，取样 0.5ml。 V3
16、=13.2ml 7.其余上清液用0.5-1mol/L NaOH 调 pH=8.0。 置冰盐浴内缓慢加入VB体积的 95的 - 4 - 配制方法：取 10ml 48mmol/L 的肌酸溶液， 加入 1.0ml 0.1mol/L 的 MgAC 2， 2.0ml 0.1 的百里酚蓝 (称 100mg 百里酚蓝，加 20ml 乙醇溶解后再加水60ml)， 1.0ml 0.1mol/L pH9.0 的 Gly-NaOH 缓冲液，称 48mg ATP 溶于此溶液， 再补加水 5.0ml， 用 0.10.2mol/L NaOH 仔细调此溶液的颜色为深紫红色（吸光度为1.82.2）即可。 五、实验步骤： （一）兔肌肌酸激酶的分离纯化： 1.将兔子化冻后取大腿肌50g， 去除结缔组织和神经后剪碎。加 200ml 0.01mol/L KCl ， 用组织打碎机 (或食品加工机 )和高速分散器各粉碎3 次以上， 每次不超过30s， 以防 过热。 2.冰浴搅拌提取15-30min，用 8000r/min ，0，离心10mi
