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1、Company Logo,贵阳中医学院 GUIYANG COLLEGE OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE,中药制剂分析设计性试验指导老师：徐文芬 组 长：张小飞 组 员：汪娥、李驰、曹会群、姚颖、吕俊、闫爱梅、王冰、蒙仁丹、陈开义、邓敏琪,2010级中药班,HPLC法测定小承气汤中大黄素和大黄酚含量,小承气汤,小承气汤出自伤寒论，处方为：大黄12g，厚朴6g，枳实9g，水煎服。以大黄为君，枳实，厚朴为臣佐。大黄泻下，治疗阳明热结，厚朴行气消满，枳实理气消痞。厚朴，枳实协同行气导滞，以助大黄的泻下作用。三者合用适用于阳明腑实证，可以治疗粘连性肠梗阻、肠麻痹、慢性胃炎
2、等。大黄含结合型、游离型蒽醌类，为了更全面控制药品质量, 参考文献 3 , 本文对方中用量较大的君药大黄的主要成分大黄酚和大黄素进行了含量测定, 建立了大黄酚和大黄素的含量测定方法, 并进 行了系统的方法学考察 。,大黄素和大黄酚结构式见下：,大黄素,大黄酚,1.仪器设备 精密仪器：高效液相色谱仪（以贵阳中医学院分析化学教研室仪器型号为准）、万分之一分析天平、超声提取器。 一般仪器：索式回流提取器、容量瓶、移液管、烧杯、玻璃棒、冷凝管、烧瓶、铁架台等基本设备。 药材和试剂 药材：大黄素大黄酚对照品和小承气汤样品颗粒（处方为：大黄12、厚朴6、枳实9）均由贵阳中医学院中药制剂分析实验室提供。标准
3、对照品：大黄素对照品、大黄酚对照品（中检院购品）。 一般试剂：水（超纯）、甲醇（色谱纯）、95%乙醇（AR）、乙腈（AR）、乙酸（AR），其余的均为分析纯。,2.实验目的：2.1建立小承气汤中大黄素和大黄酚的含量测定方法。 2.2学会和掌握高效液相色谱仪的使用方法。 2.3掌握中药制剂的定性定量分析方法。 2.4提高同学们的相互合作能力和实验创新思维。色谱仪的用法。 1建立小承气颗粒中大黄素与大黄酚含量测定的方法。,3.实验原理：高效液相色谱法是采用高压输液泵将固定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品做分离测定的色谱方法。注入的供试品有流动相带入柱内，各成分在柱内分离，并依此进入检测器，有
4、积分仪或数据处理系统记录和处理信号。,4.方法与结果4.1溶液的制备,4.1.1 供试品溶液的制备：取本品粉末（过四号筛）约0.3g精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇溶液25 mL，称定重量；置水浴加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8% 盐酸溶液10 mL，超声处理20 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取氯仿层，酸液再用三氯甲烷提取三次，每次10 mL，合并氯仿液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL 量瓶中，加甲醇至
5、刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。,Text 1,4.1.2对照品溶液的制备：精密称定大黄素 2mg、大黄酚4mg对照品，置于100m l量瓶中, 加甲醇溶解并定容至刻度, 摇匀, 得20ugm l- 1, 40ugm l- 1的混合储备液。精密吸取储备液1.0m l置10ml量瓶中, 加甲醇定容至刻度, 摇匀, 即得。,Text2,Text3,4.1.3 阴性对照品溶液的制备取除大黄以外的其他2味药材按处方制备成缺大黄样品, 再按供试品溶液方法制备。,4.2 条件的选择4.2.1 色谱条件与系统适应性实验：色谱柱：中医药剂分析实验室提供：甲醇- 0.1%磷酸( 85:15) 为流动相 ）；流
6、速为1.0ml/min；柱温30；检测波长254nm；理论踏板数为2000；进样量10ul。4.2.2 检测波长的选择 精密去对照品10ul注入液相色谱仪200nm400nm进行扫描，记录色谱图分析，当大黄素在一波长处有最大吸收时，此波长为大黄素的检测波长 。,4.3 方法学考察4.3.1 线性关系的考察 精密吸取0.1，0.5，1，2，3，4，5ml大黄素对照品，家甲醇定容至10ml，摇匀，得到5种系列浓度的大黄素对照品溶液，在4.2.1的条件下进样分析。以色谱峰面积（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，进行线性回归，计算回归方程Y=aX+b。来考察线性关系。,4.3.2专属性的考察在上述选定
7、的色谱条件下，分别进样大黄素对照品、大黄酚对照品、阴性对照样品、供试品，得到四张HPLC谱图，分析该方法的专属性。,4.3.3精密度实验 吸取同一对照品溶液，在“4.2.1”的色谱条件下，重复进样5次，每次10ul，计算峰面积的RSD=_。来考察本实验方法精密度。,4.3.4 稳定性试验取4.1.2的供试品溶液，在0，1，2，4，6，8，12h分别进样10ul，记录峰面积，RSD（%） =_。考察稳定性。（RSD（%） 3%）,4.3.5重复性实验 精密称去同一批小承气汤颗粒粉末1g,各6份，按共试品页制备项下制备，按“4.2.1”的色谱条件测定，每份样品重复3次。大黄素平均含量：_，平均含量
8、的RSD（%）=_。来考察重现性的良好性。,4.3.6 加样回收率试验精密称取已知大黄素、大黄酚含量的小承气汤颗粒粉末两倍量，6份，分别精密加入大黄素对照品溶液适量，按“4.1.2”方法制备供试品溶液，在“4.2.1”色谱条件下测定，测其平均回收率：_，RSD（%=_）4.3.7 样品含量的测定取小承气汤颗粒样品，按“4.1.2”制备供试品，“4.2.1”色谱条件进样分析，共3次，计算大黄素的含量。 。,Company Logo,5.1实验前准备事项 5.1实验前准备事项 5.1.1对照品的配制浓度 严格按照标准配制对照品浓度（低浓度），不可超过或低于一倍。 5.1.2标签配制好的对照品标签上
9、应注明：品名、批号、取样量、稀释倍数（浓度）、配制日期。 5.1.3所需玻璃仪器和容器所需玻璃仪器和容器，尽量选用棕色容量瓶进行配制。,5.2实验中注意事项,5.2.1测定时要求 5.2.2.1 样品进样前先混匀，再用0.45m滤膜过滤，再混匀后进样。 5.2.2.2对照品与样品进样量要尽量保持一致，样品峰面积与对照品峰面积尽量保持一致（不要超过一倍，可适当调整进样量或稀释倍数）。 5.2.2.3 注意系统评价：理论板数（达到标准要求）、分离度（大于1.5）、拖尾因子（0.95-1.05之间）。 5.2.2.4 平行进针要求RSD2。,请老师和同学们批评与指正 Thank you very much!制作：lv Jun,
